【摘要】：生理妊娠類(lèi)似于同種移植,作為同種移植物的胚胎在母體存活直至分娩,實(shí)際上反映母體對(duì)胚胎的免疫耐受;母體對(duì)胚胎的免疫排斥將導(dǎo)致妊娠失敗。揭示母-胎免疫耐受的確切機(jī)制,對(duì)人類(lèi)自然流產(chǎn)等妊娠疾患的防治具有重要意義;并對(duì)移植免疫學(xué)和腫瘤免疫學(xué)的研究將產(chǎn)生重要的推動(dòng)作用。 母-胎界面主要包括滋養(yǎng)細(xì)胞、蛻膜基質(zhì)細(xì)胞、蛻膜腺上皮細(xì)胞以及免疫細(xì)胞。多年來(lái)人們從不同的角度研究母-胎界面發(fā)生的生物學(xué)事件,以闡述母-胎免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制,其中包括母-胎界面Th2型免疫優(yōu)勢(shì)的形成,及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)數(shù)量與功能的變化。胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(hTSLP)是一種造血細(xì)胞因子,誘導(dǎo)炎癥局部形成Th2型優(yōu)勢(shì),參與過(guò)敏性疾病的發(fā)病。不僅如此,正常人胸腺Hassall's小體分泌hTSLP能激活胸腺樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs),從而誘導(dǎo)胸腺CD4~+CD8~-CD25~-T細(xì)胞分化為天然CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg;母-胎界面結(jié)構(gòu)及細(xì)胞組成與胸腺極其類(lèi)似。母-胎界面是否具有胸腺類(lèi)似的免疫調(diào)節(jié)功能,迄今尚不得而知。 第一部分hTSLP在人母-胎界面的表達(dá)及其調(diào)控 目的分析人胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素在母-胎界面的表達(dá)特征及其調(diào)控。 方法收集早孕期正�；虿幻髟蜃匀涣鳟a(chǎn)的絨毛與蛻膜組織,采用RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫組織/細(xì)胞化學(xué)、Western Blot、ELISA法檢測(cè)母-胎界面TSLP的表達(dá)特征,并比較hTSLP在正常早孕與流產(chǎn)之間的差別。對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行多種干預(yù),包括妊娠相關(guān)激素、Th1/Th2型細(xì)胞因子及rhTSLP處理,檢測(cè)其表達(dá)TSLP的變化。 結(jié)果RT-PCR法分析發(fā)現(xiàn),絨毛與蛻膜組織及非孕婦女子宮內(nèi)膜均轉(zhuǎn)錄TSLPmRNA。免疫化學(xué)法分析顯示,早孕絨毛外層的合體滋養(yǎng)細(xì)胞、內(nèi)層的細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞及侵襲性滋養(yǎng)細(xì)胞均表達(dá)TSLP。蛻膜腺上皮細(xì)胞(DECs)表達(dá)TSLP,基質(zhì)細(xì)胞(DSCs)不表達(dá)之。1×10~6cells/ml/孔滋養(yǎng)細(xì)胞(Tros)培養(yǎng)至48～72h時(shí),分泌TSLP水平為19.30pg/ml。絨毛與蛻膜組織及培養(yǎng)的原代細(xì)胞,正常早孕的TSLP mRNA轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)均明顯高于自然流產(chǎn)組,提示TSLP參與人正常妊娠的維持。 單獨(dú)孕酮、17β-E2或β-hCG并未顯著促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞TSLP mRNA的表達(dá):而三者聯(lián)合處理人Tros時(shí),TSLP mRNA較未處理組升高9-12倍,培養(yǎng)上清中TSLP水平升高至28.23pg/ml。TNF-α與IL-4聯(lián)合作用使TSLP mRNA水平升近2倍;而rhTSLP處理Tros,TSLP mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著升高。 結(jié)論人母-胎界面表達(dá)TSLP,滋養(yǎng)細(xì)胞是其主要來(lái)源;正常早孕Tros表達(dá)水平顯著高于不明原因自然流產(chǎn)患者。聯(lián)合使用孕酮、17β-E2與β-hCG顯著促進(jìn)Tros轉(zhuǎn)錄TSLP mRNA,并促進(jìn)Tros分泌TSLP。 第二部分滋養(yǎng)細(xì)胞通過(guò)自分泌TSLP促進(jìn)其增殖與侵襲 目的分析rhTSLP對(duì)人滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。 方法免疫化學(xué)法檢測(cè)原代滋養(yǎng)細(xì)胞是否表達(dá)TSLP受體。不同濃度rhTSLP作用于原代滋養(yǎng)細(xì)胞48h后,采用[~3H]thymidine攝取法及CCK8 kit分析滋養(yǎng)細(xì)胞增殖能力;采用transwell實(shí)驗(yàn)分析滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力。 結(jié)果免疫化學(xué)法檢測(cè)到滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)TSLP受體。外源TSLP能夠促進(jìn)原代滋養(yǎng)細(xì)胞增殖,在100-400ng/ml劑量范圍內(nèi)呈劑量依賴關(guān)系。rhTSLP亦促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲。 結(jié)論滋養(yǎng)細(xì)胞通過(guò)自分泌TSLP,促進(jìn)自我增殖與侵襲,增強(qiáng)滋養(yǎng)細(xì)胞的生物活性;這將有利于妊娠的維持。 第三部分人滋養(yǎng)細(xì)胞分泌TSLP誘導(dǎo)母-胎界面Th2型免疫優(yōu)勢(shì) 目的了解Tros能否通過(guò)分泌TSLP訓(xùn)導(dǎo)dDCs促進(jìn)母-胎界面Th2型免疫優(yōu)勢(shì)。 方法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)蛻膜免疫活性細(xì)胞表面TSLP受體水平;以rhTSLP、LPS等處理MACS分選蛻膜DCs。Tros與DCs共培養(yǎng),觀察DCs分泌細(xì)胞因子的水平。將TSLP處理DCs,與同種或同個(gè)體蛻膜CD4~+T細(xì)胞(dCD4~+T)共培養(yǎng),觀察dCD4~+T分泌的細(xì)胞因子表達(dá)譜;RT-PCR法檢測(cè)dCD4~+T細(xì)胞Th1/Th2型轉(zhuǎn)錄因子GATA-3與T-bet水平。 結(jié)果正常早孕蛻膜內(nèi)41.62%±6.84%dDCs表達(dá)TSLP功能性受體γ鏈(TSLPR-γ),顯著高于母-胎界面其他免疫細(xì)胞表達(dá)水平。rhTSLP刺激dDCs,或dDCs與Tros共培養(yǎng)24h后,dDCs被激活;活化dDCs分泌高水平IL-10與CCL17,及低水平TNF-α;TSLP中和抗體能夠抑制Tros對(duì)dDCs的訓(xùn)導(dǎo),使dDCs分泌IL-10與CCL17下降至對(duì)照組水平。rhTSLP或Tros培養(yǎng)上清處理dDCs 24h后,dDCs與dCD4~+T細(xì)胞共培養(yǎng)5d,其培養(yǎng)上清Th2型細(xì)胞因子IL4、IL-10水平顯著高于對(duì)照組;而Th1型因子IFN-γ與TNF-α水平顯著低于對(duì)照組。dCD4~+T細(xì)胞經(jīng)TSLP-DCs作用7d后,其Th2型轉(zhuǎn)錄因子GATA-3水平顯著升高。 結(jié)論Tros通過(guò)分泌TSLP訓(xùn)導(dǎo)dDCs,并使dDCs分泌高水平IL-10與CCL17;TSLP-dDCs則誘導(dǎo)dCD4~+T細(xì)胞呈現(xiàn)Th2型偏移,從而形成有利于正常妊娠的免疫微環(huán)境。 第四部分人滋養(yǎng)細(xì)胞通過(guò)TSLP訓(xùn)導(dǎo)dDCs使dCD4~+T細(xì)胞分化為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg) 目的研究Tros是否通過(guò)分泌TSLP訓(xùn)導(dǎo)dDCs,以誘導(dǎo)蛻膜Treg分化與擴(kuò)增。 方法rhTSLP、LPS等處理dDCs,或原代滋養(yǎng)細(xì)胞與dDCs共培養(yǎng)24h后,流式細(xì)胞術(shù)觀察DCs表面標(biāo)志的變化。將TSLP-DCs與同個(gè)體dCD4~+CD25~-T或dCD4~+CD25~+T細(xì)胞共培養(yǎng)7d,觀察CD4~+Foxp3~+Treg數(shù)量與比例的變化,并以TGF-β中和抗體拮抗培養(yǎng)體系中TGF-β的功能,觀察Treg比例的變化。同時(shí)觀察誘導(dǎo)產(chǎn)生的Treg是否具有免疫無(wú)能性或免疫抑制性。 結(jié)果Tros與dDCs共培養(yǎng)后,dDCs表面協(xié)同刺激分子CD80、CD86等顯著升高。rhTSLP-dDCs與同個(gè)體dCD4~+CD25~-T或dCD4~+CD25~+T細(xì)胞共培養(yǎng)7d后,Treg明顯擴(kuò)增;且主要是CD4~+Foxp3~+Treg顯著增多;這種誘導(dǎo)Treg分化與擴(kuò)增的能力可以被TGF-β1中和抗體所抑制。母-胎界面誘導(dǎo)產(chǎn)生的Treg具有自身擴(kuò)增無(wú)能與抑制CD4~+CD25~-T細(xì)胞增殖的能力。 結(jié)論Tros通過(guò)分泌TSLP活化dDCs,并誘導(dǎo)dCD4~+T細(xì)胞向CD4~+Foxp3~+ Treg分化,這種誘導(dǎo)產(chǎn)生的Treg具有免疫無(wú)能性與免疫抑制性。 小結(jié)本文通過(guò)RT-PCR、免疫化學(xué)及免疫印跡法檢測(cè)到人母-胎界面表達(dá)胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP),并發(fā)現(xiàn)它在正常早孕的絨毛與蛻膜中表達(dá)水平顯著高于不明原因流產(chǎn)組。rhTSLP處理或與Tros共培養(yǎng)后,dDCs表面協(xié)刺激分子與HLA-DR升高并且高水平分泌IL-10與CCL17。TSLP-dDCs能夠誘導(dǎo)同種或同個(gè)體dCD4~+T細(xì)胞向Th2型偏移;同時(shí),TSLP-dDCs誘導(dǎo)同個(gè)體dCD4~+T細(xì)胞分化發(fā)育為CD4~+Foxp3~+Treg,表明在母-胎界面局部存在Treg分化與擴(kuò)增的機(jī)制。這些發(fā)現(xiàn)表明,來(lái)自胎兒成份的Tros,通過(guò)分泌TSLP,訓(xùn)導(dǎo)母體免疫細(xì)胞產(chǎn)生有利于妊娠的免疫微環(huán)境。
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【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳巧英;李大金;金莉萍;朱曉勇;朱影;王明雁;袁敏敏;孟毅;;早孕期外周血及蛻膜淋巴細(xì)胞CD28/CTLA-4的表達(dá)[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;2005年12期

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本文編號(hào)：2318002