【摘要】：背景和目的 DNA聚合酶β(DNA polymeraseβ,polβ)是一種重要的DNA修復(fù)酶,它廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)。該酶的主要功能是參與DNA的修復(fù),在堿基切除修復(fù)(BER)過程中填補(bǔ)單核苷酸缺口,包括短補(bǔ)丁(單一核苷酸)BER途徑和/或長(zhǎng)補(bǔ)丁(幾個(gè)核苷酸合并)BER途徑,是現(xiàn)今已知堿基切除修復(fù)中最重要的聚合酶之一。該酶在哺乳類動(dòng)物細(xì)胞的同源性和在結(jié)構(gòu)進(jìn)化過程中的高度保守性說明其在生命活動(dòng)中起著重要作用,有人稱其是生物進(jìn)化過程的“看家酶”。該酶的缺陷與一些腫瘤的發(fā)生有關(guān)。目前,已在食管癌、胃癌、直腸癌、前列腺癌、鼻咽癌等多種人類腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了polβ基因的突變及表達(dá)異常。近年來,許多學(xué)者對(duì)polβ在腫瘤組織和細(xì)胞系中的突變及表達(dá)狀態(tài)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。然而,腫瘤組織中突變polβ的功能改變尚未見有報(bào)道。因此,本課題在課題組先前研究的基礎(chǔ)上,構(gòu)建162位Val→Ala突變型DNA聚合酶β(DNA聚合酶βM162突變型)和野生型DNA聚合酶β表達(dá)載體,誘導(dǎo)表達(dá)、純化得到的重組蛋白,檢測(cè)它們對(duì)單堿基缺失DNA底物的修復(fù)能力,為探討修復(fù)基因DNA聚合酶β突變?cè)谀[瘤發(fā)生發(fā)展中的作用積累實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法 設(shè)計(jì)一對(duì)帶有BamHⅠ和HindⅢ酶切位的polβcDNA引物;分別以含有野生型polβcDNA克隆pGEM-T-Wpolβ和162位Val→Ala突變型DNA聚合酶β(M162突變型)cDNA克隆pGEM-T-Mpolβ的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增;BamHⅠ和HindⅢ酶切Wpolβ和Mpolβ擴(kuò)增產(chǎn)物,將其重組入pQE80L;利用PCR篩選和酶切鑒定得到pQE80L-Wpolβ和pQE80L-Mpolβ,進(jìn)行DNA序列測(cè)定。1mmol/LIPTG分別誘導(dǎo)含有pQE80L-Wpolβ和pQE80L-Mpolp的大腸桿菌DH5α,37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)5h;超聲破碎細(xì)胞,并通過紫外分光光度法測(cè)定蛋白含量。然后15%SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍(lán)R-250染色,甲醇-冰醋酸脫色并觀察,采用凝膠分析系統(tǒng)掃描,分析SDS-PAGE后凝膠上的染色條帶。 通過Hislink~(TM)蛋白純化試劑盒純化蛋白,純化的蛋白按常規(guī)法用8M尿素復(fù)性,通過紫外分光光度法測(cè)定蛋白含量,將得到的野生型和突變型DNA聚合酶β蛋白都稀釋為400ng/ml。設(shè)計(jì)合成帶有HindⅢ酶切位點(diǎn)的單堿基缺失DNA底物的三條單鏈P1、P2和P3,退火后合成含有一個(gè)堿基缺失的DNA底物;稀釋野生型和突變型DNA聚合酶β蛋白對(duì)DNA底物進(jìn)行堿基缺失的DNA底物的修復(fù),HindⅢ酶切修復(fù)DNA底物,判定BER活性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.重組表達(dá)載體pQE80L-Wpolβ和pQE80L-Mpolβ經(jīng)PCR和酶切鑒定,證實(shí)載體構(gòu)建成功。DNA序列測(cè)定,證實(shí)表達(dá)載體的插入片段與pGEM-T-Wpolβ和pGEM-T-Mpolβ中序列完全一致。 2.通過誘導(dǎo)表達(dá)、純化得到的39KD的野生型和突變型polβ蛋白,與預(yù)期的融合蛋白大小一致。 3.三條單鏈P1、P2、P3退火后合成含有一個(gè)堿基缺失的56bp的DNA底物,與預(yù)期大小相符。 4.在BER實(shí)驗(yàn)中,1:4稀釋即polβ100ng/ml時(shí),野生型polβBER活性為100%,而突變型polβBER活性僅為29%±4%;1:8稀釋即polβ50ng/ml時(shí),野生型polβBER活性為78%±9%,而突變型polβBER活性僅為5%±1.3%;1:16稀釋即polβ25ng/ml時(shí),野生型polβBER活性仍然有32%±4%,而突變型polβBER活性已經(jīng)降為0%;統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,在三個(gè)稀釋度上,野生型polβBER活性都顯著高于突變型polβ,p＜0.01,差異均有非常顯著性。 結(jié)論 DNA聚合酶βM162突變型,即DNA 598位T突變?yōu)镃,引起polβ氨基酸162位Val突變?yōu)锳la,導(dǎo)致polβ蛋白活化結(jié)構(gòu)域“掌部”空間結(jié)構(gòu)改變,致使BER活性顯著降低。
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【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R346;R73-3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2316517