【摘要】： 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種常見的漸進性神經(jīng)退行性疾病。其典型的病理特征為大腦皮層及海馬區(qū)的β淀粉樣肽(Amyloidβ-peptide,Aβ)在胞外積累并形成老年斑(senile plaque,SP)、腦神經(jīng)細胞內(nèi)tau蛋白異常聚集形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle,NFT)以及神經(jīng)元突觸功能異常及錐體神經(jīng)細胞丟失。目前認為Aβ是導(dǎo)致神經(jīng)元損傷及認知功能障礙的主要致病物質(zhì)。研究表明,針對Aβ的主動免疫和被動免疫療法可以減少轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠腦內(nèi)聚集的Aβ纖維,并且能夠明顯改善模型小鼠的認知能力。 本課題主要進行了Aβ_(1-42)寡聚體單克隆抗體(McAb,以下簡稱單抗)的制備、鑒定以及其體內(nèi)、外功能研究。 一Aβ寡聚體單抗的制備及性質(zhì)鑒定 在體外將化學(xué)合成的Aβ_(1-42)聚合成Aβ寡聚體,用Aβ寡聚體免疫小鼠,取免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞進行細胞融合,通過有限稀釋法克隆和間接ELISA篩選,獲得穩(wěn)定分泌Aβ寡聚體單抗的雜交瘤細胞株。將雜交瘤細胞注入小鼠腹腔誘生腹水,采用A蛋白親和層析從腹水中純化制備Aβ單抗。并通過SDS-PAGE檢測純化后抗體的純度,Western Blot檢測單抗對Aβ寡聚體的識別,競爭ELISA測定單抗的抗原識別表位與親和常數(shù)。結(jié)果顯示:獲得一株穩(wěn)定分泌Aβ寡聚體單抗的雜交瘤細胞株(A8),純化后單抗A8的純度達到95%以上。A8對16.5-25 KD的Aβ寡聚體有較高的親和力,為IgG3亞類,抗原識別表位位于Aβ分子N端的1-6位氨基酸,親和常數(shù)為7.89×10~(-8)。 二A8單抗的體外及體內(nèi)生物學(xué)活性研究 為了解單抗A8對Aβ寡聚體誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞損傷的保護作用,以Aβ寡聚體誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞損傷,用CCK8檢測細胞活性。結(jié)果顯示:1μmol/L單抗A8可顯著降低20μmol/L Aβ寡聚體對細胞的毒性作用(p＜0.05)。所以單抗A8可以在體外抑制Aβ寡聚體對SH-SY5Y細胞的毒性。 隨后我們利用SAMP8模型小鼠,對單抗A8的治療作用進行了探討,取8周齡SAMP8小鼠腹腔注射A8(500μg/只),治療結(jié)束后進行Morris水迷宮行為學(xué)實驗,之后處死小鼠取腦,做石蠟切片免疫組化分析,并對鼠腦全蛋白做WesternBlot檢測。結(jié)果顯示,治療組小鼠行為學(xué)有一定改善,大腦中的Aβ水平及磷酸化tau蛋白降低(p＜0.05),tau蛋白沒有變化。 三A8單抗輕鏈重鏈可變區(qū)基因的克隆與分析 人源化改造是鼠源單抗用于人體的重要基礎(chǔ),為此我們采用5′RACE法擴增與克隆了A8單抗的輕鏈、重鏈可變區(qū)基因,并克隆入pMD18-T載體中。測序結(jié)果顯示重鏈可變區(qū)基因序列全長450 bp,編碼150個氨基酸;輕鏈可變區(qū)基因序列全長429 bp,編碼143個氨基酸。在GeneBank對氨基酸序列進行比對分析,二者均符合小鼠IgG可變區(qū)基因的特征。 總之,我們成功制備并獲得了Aβ寡聚體單抗A8,該抗體對Aβ寡聚體有較高的親和力,為IgG3亞類,抗原識別表位位于Aβ分子N端的1-6位氨基酸,親和常數(shù)為7.89×10~(-8)。體外實驗表明該抗體可抑制Aβ寡聚體對SH-SY5Y細胞的毒性,SAMP8 AD模型小鼠治療實驗顯示,A8抗體可降低小鼠大腦中的Aβ水平及磷酸化tau蛋白,能夠改善SAMP8 AD模型認知記憶功能。同時我們還克隆了該抗體的可變區(qū)基因,并得到了可變區(qū)序列信息。這些工作為進一步開展A8轉(zhuǎn)基因小鼠的治療性研究、人源化改造及AD診斷研究奠定了基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：北京交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R749.1;R392

【引證文獻】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 宋琳琳;Aβ寡聚體特異性單鏈抗體的構(gòu)建、表達和生物學(xué)功能研究[D];北京交通大學(xué);2012年

2 肖碩;Aβ寡聚體選擇性單抗對阿爾茨海默病雙轉(zhuǎn)基因小鼠治療效果的研究[D];北京交通大學(xué);2012年

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本文編號：2314253