【摘要】： 大面積燒傷、創(chuàng)傷、糖尿病、褥瘡等原因常造成皮膚正常組織結(jié)構(gòu)及完整性的破壞而形成創(chuàng)面(包括難愈性潰瘍)。在無足夠自體皮膚進(jìn)行移植等限制下,如何及時(shí)有效的修復(fù)創(chuàng)面、重建愈后皮膚正常組織結(jié)構(gòu)以盡可能達(dá)到恢復(fù)皮膚正常功能的生理性愈合,是目前創(chuàng)面臨床治療的難點(diǎn)。 間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是來源于中胚層并具有多分化潛能的一類干細(xì)胞,廣泛的存在于人骨髓、臍帶血及胚胎前體組織中,已被應(yīng)用于組織工程和細(xì)胞替代治療。近年來研究發(fā)現(xiàn),MSC可以跨越胚層界限向皮膚等上皮組織細(xì)胞分化,參與組織損傷的修復(fù)和功能重建。臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(UCB MSC)較骨髓來源的MSC更接近胚胎干細(xì)胞,具有來源更充足、抗原性更低,無創(chuàng)獲取等優(yōu)勢,作為一種新型的種子細(xì)胞而倍受關(guān)注。 本研究中,我們從新生兒臍帶血中分離培養(yǎng)MSC,BrdU標(biāo)記示蹤后移植入皮膚缺損創(chuàng)面的SCID小鼠體內(nèi)。通過檢測創(chuàng)面愈合率和皮膚新愈組織內(nèi)供體細(xì)胞的分布及分化情況,探討了UCB MSC在體內(nèi)向表皮細(xì)胞分化并促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的可能性,為臨床應(yīng)用人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)創(chuàng)面提供理論及實(shí)踐依據(jù)。 材料和方法 一、UCB MSC體外分離培養(yǎng) 應(yīng)用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法從新鮮臍帶血中分離MNC,接種于胎牛血清包被過的塑料培養(yǎng)皿中,采用含15%胎牛血清、100U/ml青霉素G、100ug/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基(PH值7.2-7.4),在37℃、5%CO2及飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。過夜即全量換液,棄去未貼壁細(xì)胞。此后每3天換液一次。5-7天后在顯微鏡下挑取出現(xiàn)的MSC克隆,2.5g/L胰酶消化吹散,同前條件傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至80-90%融合時(shí),按1:3比例消化傳代培養(yǎng)。 二、流式細(xì)胞技術(shù)鑒定UCB MSC 消化、收集P7代UCB MSC,應(yīng)用相關(guān)抗體染色后在BD Caliber流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面分子CD29、CD34、CD105、HLA-DR的表達(dá)。 三、不同代數(shù)UCB MSC體外增殖能力的測定 消化收集細(xì)胞后以1×103cell/孔接種于24孔板中,3d換液一次,每隔1天隨即抽取2孔消化計(jì)數(shù)、取平均值,連續(xù)記錄12天。以細(xì)胞數(shù)為縱軸,時(shí)間為橫軸,繪制P3、P10代以及BrdU標(biāo)記的P10代UCB MSC細(xì)胞生長曲線,比較不同代數(shù)以及BrdU標(biāo)記后細(xì)胞的增殖能力。 四、BrdU標(biāo)記UCB MSC 將新鮮消化下來的P9代UCB MSC采用含終濃度5μmol/L的BrdU、15%胎牛血清、100U/ml青霉素G、100ug/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2及飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。此后3d換液一次,待細(xì)胞生長至60%融合時(shí),免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測BrdU陽性細(xì)胞率。同時(shí)如上檢測BrdU標(biāo)記后對細(xì)胞增殖的影響。 五、移植UCB MSC修復(fù)SCID小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面 1.創(chuàng)面種植UCB MSC 取4周齡雄性SCID小鼠8只,于小鼠背部中線兩側(cè)各制造1×2cm2全層皮膚缺損。消化收集BrdU標(biāo)記的P9代UCB MSC,以PBS調(diào)整細(xì)胞懸液密度為2.5×106/ml,將200μl細(xì)胞懸液均勻涂布至左側(cè)創(chuàng)面(治療組),右側(cè)僅涂布PBS(對照組),雙側(cè)均以油紗覆蓋。于術(shù)后7、14天用無菌透明膜描印創(chuàng)面大小,計(jì)算比較兩組創(chuàng)面愈合率。 2.尾靜脈注射移植UCB MSC 按上述方法建立皮膚全層缺損動(dòng)物模型,設(shè)立實(shí)驗(yàn)組和對照組各8只。通過尾靜脈注射將BrdU標(biāo)記的P7代UCB MSC移植入實(shí)驗(yàn)組SCID小鼠體內(nèi),細(xì)胞數(shù)量為2.5×105/只,對照組注入同體積PBS,創(chuàng)面均以豬皮縫合覆蓋。 六、組織學(xué)檢查 于移植術(shù)后第7、14、28天取治療組和對照組小鼠創(chuàng)周新愈皮膚組織活檢,行常規(guī)病理檢查(HE染色)。在光鏡下(×400)觀察兩組創(chuàng)面新愈組織表皮層厚度以及細(xì)胞層數(shù),比較兩組創(chuàng)面愈合情況。 七、免疫組織化學(xué)染色 于移植術(shù)后第7、14、28天取兩組創(chuàng)面新愈皮膚組織;于尾靜脈注射UCB MSC術(shù)后第28天治療組小鼠遠(yuǎn)離創(chuàng)面的正常皮膚組織及心、肝等臟器,石蠟包埋切片,SABC法免疫組化染色檢測BrdU陽性細(xì)胞在上述組織的分布情況。并取尾靜脈注射術(shù)后不同時(shí)相點(diǎn)治療組創(chuàng)面新愈組織切片,在光鏡下(×400)每隔500μm計(jì)數(shù)一個(gè)視野內(nèi)表皮基底層BrdU陽性細(xì)胞數(shù),連續(xù)計(jì)數(shù)3個(gè)視野,求其平均值。另行免疫組化雙染色檢測BrdU陽性細(xì)胞及其K19和廣譜角蛋白的表達(dá)情況,初步探討UCB MSC在體向人表皮細(xì)胞分化的可能機(jī)制。 結(jié)果 一、UCB MSC體外分離培養(yǎng)、標(biāo)記及表面標(biāo)志物的鑒定 優(yōu)化的分離培養(yǎng)條件傳至第3代可以獲得較均一的UCB MSC。細(xì)胞形態(tài)均一,為梭形或成纖維樣,呈漩渦樣生長。流式檢測顯示UCB MSC表達(dá)CD29(90.30%)、CD105(86.48%),不表達(dá)CD34和HLA-DR。免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測BrdU標(biāo)記P9代UCB MSC標(biāo)記率約為60%。 二、UCB MSC體外增值特性 UCB MSC體外培養(yǎng)指數(shù)生長期倍增時(shí)間約為36h,傳代接種后1-2 d為潛伏期,從第3天開始細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期,開始大量增殖。到第9天達(dá)到高峰,以后速度減慢,進(jìn)入平臺(tái)期。P3、P10代MSC增值速度及生長周期沒有明顯改變。BrdU標(biāo)記對UCB MSC的形態(tài)、增殖速度及生長周期無明顯影響。 三、移植UCB MSC修復(fù)小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面 1.創(chuàng)面種植UCB MSC術(shù)后治療組創(chuàng)面愈合率高于對照組(P0.01)。術(shù)后第7d治療組(56.06±3.04)%,對照組(36.99±2.17)%;術(shù)后第14d治療組(94.75±1.89)%,對照組(84.63±2.28)%。 2.組織學(xué)檢查表明,治療組愈合效果優(yōu)于對照組。比較術(shù)后7、14天治療組和對照組創(chuàng)周新愈皮膚組織表皮厚度及表皮細(xì)胞數(shù)目顯示,治療組活檢組織表皮層明顯增厚,細(xì)胞及表皮嵴數(shù)目顯著增多;并在治療組活檢組織中發(fā)現(xiàn)有少量皮膚附屬器如毛囊形成。 3.免疫組化檢測UCB MSC在小鼠體內(nèi)的分布情況 通過創(chuàng)面直接種植或尾靜脈注射兩種方式移植UCB MSC,在術(shù)后不同時(shí)相點(diǎn)的創(chuàng)面新愈組織中都可以檢測到來源于臍帶血的供體細(xì)胞。BrdU染色陽性主要分布于治療組創(chuàng)面新愈組織的表皮基底層、毛囊內(nèi)層、棘層以及皮下組織;在形態(tài)學(xué)上此類細(xì)胞呈立方形和圓形,與周圍受體本身的表皮細(xì)胞無明顯差異,可見其相鄰生長。比較以上兩種移植方式,后者定植于創(chuàng)面的UCB MSC較多。 尾靜脈注射移植術(shù)后,第7天創(chuàng)面新愈組織表皮基底層BrdU陽性細(xì)胞數(shù)多于移植后第14天(P0.01),而移植后第28天與第14天相比表皮基底層BrdU陽性細(xì)胞數(shù)無明顯變化(P0.05)。術(shù)后第28天檢測結(jié)果顯示,在治療組小鼠遠(yuǎn)離創(chuàng)面的正常皮膚中僅可見少量隨機(jī)分布BrdU陽性細(xì)胞,其數(shù)量遠(yuǎn)低于創(chuàng)面新愈組織;在治療組小鼠的肝臟及心臟中也檢測到有UCB MSC定植,其數(shù)量較少,主要分布于肝小葉中央靜脈壁內(nèi)層和心肌組織中,對照組均為陰性。 四、UCB MSC在小鼠體內(nèi)向表皮(干)細(xì)胞分化情況 免疫組織化學(xué)雙染色結(jié)果顯示,尾靜脈注射UCB MSC術(shù)后第28天在創(chuàng)面新愈組織的表皮基底層、再生皮膚附件毛囊內(nèi)層,可見部分BrdU陽性細(xì)胞同時(shí)表達(dá)抗K19陽性或抗廣譜角蛋白陽性,對照組為陰性;表明部分供體來源的UCB MSC可在創(chuàng)面向表皮(干)細(xì)胞分化。 討論與結(jié)論 一、分離所得的MNC接種于胎牛血清包被的培養(yǎng)板后,過夜即全量換液,可以提高M(jìn)SC克隆形成率,更好的排除破骨樣細(xì)胞混雜生長的影響,有利于MSC的增殖純化、提高足月新生兒臍帶血MSC的培養(yǎng)成功率。 二、創(chuàng)面應(yīng)用UCB MSC移植后,可以顯著提高創(chuàng)面愈合率,改善創(chuàng)面愈合效果。治療組創(chuàng)面更接近生理性愈合的效果,其新愈皮膚組織的表皮層厚度增加、細(xì)胞層數(shù)增多;且證實(shí)有部分供體細(xì)胞參與了創(chuàng)面再生皮膚附件的形成。通過免疫組化雙染色結(jié)果,初步推斷其機(jī)制為皮膚損傷條件下的創(chuàng)面微環(huán)境可以誘導(dǎo)UCB MSC在小鼠體內(nèi)向表皮(干)細(xì)胞分化。移植UCB MSC可以通過補(bǔ)充創(chuàng)面修復(fù)細(xì)胞的數(shù)量參與創(chuàng)面的修復(fù)和重建,可以促進(jìn)創(chuàng)面愈合速度,改善創(chuàng)面愈合質(zhì)量。 三、尾靜脈注射移植UCB MSC術(shù)后治療組小鼠遠(yuǎn)離創(chuàng)面的正常皮膚中,只有少數(shù)供體細(xì)胞隨機(jī)分布;且隨著創(chuàng)面的愈合,供體細(xì)胞定植于創(chuàng)面的細(xì)胞數(shù)量有減少趨勢,但在愈合后期,這種趨勢不再繼續(xù)。實(shí)驗(yàn)表明創(chuàng)面的存在對UCB MSC有較強(qiáng)的趨化作用,有利于更多的MSC參與創(chuàng)面修復(fù)。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R329

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2304182