【摘要】：高級糖基化終產(chǎn)物受體(Receptor for advanced glycation end product, RAGE)屬于細(xì)胞膜上的免疫球蛋白超家族成員之一,與多種年齡相關(guān)性疾病有關(guān),包括阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD),糖尿病和炎癥性疾病。完整的RAGE蛋白包括一個細(xì)胞膜外高變區(qū)(V),兩個穩(wěn)定的膜外免疫球蛋白樣(Ig-like)區(qū)域,一個跨膜區(qū)和一個短的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域。RAGE的高變區(qū)能與多種配體結(jié)合,從而活化細(xì)胞。RAGE的配體之一為β-淀粉樣蛋白(amyloid P-peptide, Aβ), Aβ在阿爾茨海默病病人的腦中累積,是神經(jīng)元內(nèi)纖維纏結(jié)及腦實(shí)質(zhì)中老年斑形成的病理基礎(chǔ)。在Aβ與小牛肺部提取物結(jié)合位點(diǎn)的研究中,發(fā)現(xiàn)分子量為-50和-35KDa的蛋白條帶均能與β-淀粉樣蛋白結(jié)合,氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)兩條分子條帶都包含RAGE序列,其中后者為RAGE的細(xì)胞膜外區(qū)域(RAGE細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域缺失),是經(jīng)蛋白酶水解后的RAGE片斷,其功能為阻斷RAGE與配體結(jié)合后的信號傳導(dǎo)。進(jìn)一步研究證明,在阿爾茨海默病病人腦組織、神經(jīng)元、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和血管成分中RAGE表達(dá)增加,與β-淀粉樣蛋白的累積部位相同。在體外細(xì)胞培養(yǎng)模型中,將β-淀粉樣蛋白與轉(zhuǎn)染RAGE的細(xì)胞共孵育導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激的產(chǎn)生和NF-kB信號的活化。RAGE蛋白在血腦屏障(Blood Brain Barrier, BBB)轉(zhuǎn)運(yùn)Aβ中有重要作用。然而,RAGE調(diào)節(jié)Aβ穿越血腦屏障的機(jī)制尚不清楚。為此,筆者運(yùn)用穩(wěn)定高表達(dá)人類RAGE蛋白的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞系(ECV304)為模型進(jìn)行研究,結(jié)果顯示RAGE高表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞之間的粘附連接(Adheren junctions, AJs)受損,單層細(xì)胞膜的細(xì)胞旁通透性發(fā)生改變。進(jìn)一步研究證明,RAGE蛋白高表達(dá)引起粘附連接相關(guān)蛋白β-catenin水平上調(diào),F-actin細(xì)胞骨架的重塑和未成熟細(xì)胞粘附連接增加。此外,在RAGE穩(wěn)定高表達(dá)的內(nèi)皮細(xì)胞系中,隨細(xì)胞密度增加的胞質(zhì)緊密連接蛋白(ZO-1)水平上調(diào)被阻斷,與之相應(yīng)的細(xì)胞緊密連接(Tight junctions, TJs)受損,細(xì)胞旁通透性增加。在穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域缺失RAGE (D/N-RAGE)的內(nèi)皮細(xì)胞中并未觀察到上述改變。表明RAGE調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞通透性依賴其細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的信號傳導(dǎo)。 RAGE與其相應(yīng)配體結(jié)合能引起細(xì)胞生物學(xué)性質(zhì)(包括細(xì)胞增殖,炎性介質(zhì)的產(chǎn)生,細(xì)胞移行以及細(xì)胞膜通透性)的改變。RAGE蛋白的高變區(qū)能與不同的配體結(jié)合,RAGE與配體結(jié)合后細(xì)胞活化的信號傳導(dǎo)依賴于其細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域,但到目前為止,尚不清楚RAGE兩個膜外Ig-like結(jié)構(gòu)域的作用。為了研究RAGE各結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞膜通透性改變中的作用,在完整RAGE基因的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了一系列能表達(dá)RAGE結(jié)構(gòu)域蛋白的質(zhì)粒：pcDNA 6.2-RAGE-△IgG (RAGE高變區(qū)缺失),pcDNA 6.2-RAGE-△IgC1 (RAGE膜外近N端Ig-like區(qū)缺失),pcDNA 6.2-RAGE-△IgC2 (RAGE膜外近C端Ig-like區(qū)缺失),并將其表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞系ECV-304,免疫熒光染色研究發(fā)現(xiàn),RAGE-△IgG和RAGE-△IgC1蛋白分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),而全長RAGE, RAGE-△IgC2及D/N-RAGE蛋白分布于細(xì)胞膜上和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；在表達(dá)RAGE-△IgG和RAGE-△IgC1蛋白的ECV-304細(xì)胞中,其細(xì)胞骨架stress fiber與ECV-304細(xì)胞沒有顯著差別,而RAGE和RAGE-△IgC2表達(dá)的細(xì)胞,其stress firber顯著減少。 綜上所述,RAGE蛋白在細(xì)胞膜上的表達(dá)增加,導(dǎo)致β-catenin水平上調(diào),F-actin細(xì)胞骨架的重塑和未成熟細(xì)胞粘附連接增加,但依賴細(xì)胞密度增加的zO-1水平上調(diào)被阻斷,細(xì)胞旁通透性增加,揭示在阿爾茨海默病及糖尿病血管病并發(fā)癥中,RAGE在血管病病理發(fā)生的新機(jī)制,RAGE高變區(qū)及RAGE膜外近N端Ig-like區(qū)域可成為干預(yù)治療細(xì)胞通透性增加的新目標(biāo)。
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【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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1 李國勤;盧立志;;動物關(guān)鍵模式識別受體及其抗病毒天然免疫作用研究進(jìn)展[J];生命科學(xué);2011年01期

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本文編號：2301745