【摘要】： 近年來，人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells，hESCs)向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的成功，為各種難治性神經(jīng)系統(tǒng)疾病細(xì)胞移植治療提供了理想的載體。從胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為特異的神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)鍵步驟是神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)的生成。目前采用的hESCs分化為NSCs的誘導(dǎo)方法大致可分為三種：一是經(jīng)擬胚體(embryonic bodies，EBs)誘導(dǎo)法。通過模仿胚胎內(nèi)生成神經(jīng)外胚層的環(huán)境來產(chǎn)生神經(jīng)干細(xì)胞，是應(yīng)用最廣泛的誘導(dǎo)方法。但是該法周期長，所需hESCs細(xì)胞量大，操作技術(shù)含量較高。二是與具有特殊誘導(dǎo)能力的基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)法。不過基質(zhì)細(xì)胞所提供因子的具體作用未被闡述，是否對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有后續(xù)作用尚需進(jìn)一步觀察，一定程度上阻礙其應(yīng)用；三是用特定的誘導(dǎo)因子使胚胎干細(xì)胞直接定向分化法。研究發(fā)現(xiàn)去除細(xì)胞內(nèi)各種抑制神經(jīng)分化的信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞間相互抑制作用時(shí)，未分化的ESCs會(huì)自發(fā)向神經(jīng)細(xì)胞分化，基于此產(chǎn)生了直接分化法。該法誘導(dǎo)hESCs生成NSCs已有報(bào)道，但尚未形成統(tǒng)一有效的誘導(dǎo)方法。對(duì)脊椎動(dòng)物成體內(nèi)神經(jīng)發(fā)生的研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞通過產(chǎn)生血管微環(huán)境(vascular niche)，促進(jìn)成體神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。在體外，內(nèi)皮細(xì)胞也可以誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化成神經(jīng)元。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是內(nèi)皮細(xì)胞分泌的主要因子，在這些體內(nèi)外過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。VEGF通過VEGFR2．對(duì)海馬等腦組織內(nèi)神經(jīng)發(fā)生區(qū)的神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)揮促生長、存活和趨化的作用。研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞本身也可以產(chǎn)生分化調(diào)控信號(hào)來調(diào)節(jié)自身的增殖分化。諸多研究初步揭示了Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在維持神經(jīng)干細(xì)胞多能性、調(diào)節(jié)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞分化中有重要作用。此外，研究表明絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)，各種細(xì)胞外刺激信號(hào)均可通過這一通路影響突觸傳遞，神經(jīng)元的重塑和生存等。本研究對(duì)經(jīng)EB法與直接分化法誘導(dǎo)hESCs生成NSCs進(jìn)行比較，以探索適合臨床應(yīng)用的經(jīng)濟(jì)高效的誘導(dǎo)方法。隨后將探討在體外hESCs神經(jīng)分化中VEGF是否發(fā)揮作用，該作用與Notch和p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否相關(guān)，以更深入的研究神經(jīng)發(fā)生過程，，明確神經(jīng)細(xì)胞分化中的決定因素和其中的各種相互關(guān)系。 第一部分人胚胎干細(xì)胞體外分化為神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)方法的研究 目的探討適合臨床應(yīng)用的經(jīng)濟(jì)高效的人胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞的方法。 方法人胚胎干細(xì)胞生長成熟后，將其脫離飼養(yǎng)層，分離消化為單細(xì)胞，以1×10~5的細(xì)胞密度置于培養(yǎng)皿(板)中，用直接分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化。 結(jié)果用直接分化培養(yǎng)基培養(yǎng)脫離飼養(yǎng)層的hESCs，約14～16天生成nestin陽性的NSCs。神經(jīng)干細(xì)胞繼續(xù)分化，可以得到不同數(shù)量的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，MAP2、GFAP分別陽性。 結(jié)論在體外人胚胎干細(xì)胞不經(jīng)EB，可以直接定向分化為神經(jīng)干細(xì)胞。該方法與傳統(tǒng)的經(jīng)EB法相比，周期短、操作過程簡單、成本低，可用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病移植治療研究中hESCs向NSCs分化的大批量誘導(dǎo)。 第二部分血管內(nèi)皮生長因子在體外hESCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞中的作用研究 目的觀察血管內(nèi)皮生長因子在體外hESCs分化為神經(jīng)細(xì)胞過程中是否發(fā)揮作用。 方法人胚胎干細(xì)胞經(jīng)擬胚體向神經(jīng)細(xì)胞分化，分別給予VEGF(10ng／mL)和VEGF(10ng／mL)+VEGFR2／Fc嵌合體(10ng／mL)添加入神經(jīng)細(xì)胞分化的各個(gè)階段，通過RT-PCR、免疫熒光法檢測各階段細(xì)胞標(biāo)志物，計(jì)算并用流式細(xì)胞儀檢測各組神經(jīng)干細(xì)胞Nestin的陽性率。 結(jié)果RT-PCR檢測到各階段細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)，在人神經(jīng)干細(xì)胞檢測到VEGFR2表達(dá)；免疫熒光法檢測，VEGF作用組產(chǎn)生神經(jīng)干細(xì)胞、分化為神經(jīng)元的比率明顯高于常規(guī)經(jīng)EB誘導(dǎo)組和VEGF+VEGFR2／Fc嵌合體作用組，常規(guī)誘導(dǎo)組和VEGF+VEGFR2／Fc嵌合體作用組之間各階段陽性細(xì)胞率無明顯差異。 結(jié)論人神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)VEGFR2；在體外人胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化過程中，小劑量(10ng／mL)血管內(nèi)皮生長因子通過血管內(nèi)皮生長因子受體2，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖及向神經(jīng)元分化。 第三部分人胚胎干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞中VEGF作用機(jī)制的初步研究 目的研究血管內(nèi)皮生長因子在體外hESCs分化為神經(jīng)元過程中的作用機(jī)制。 方法人胚胎干細(xì)胞經(jīng)擬胚體向神經(jīng)元分化，在VEGF(10ng／mL)作用之前，分別在各階段細(xì)胞中給予γ-分泌酶抑制劑和p38 MAPK抑制劑作用1h，免疫熒光法計(jì)算各階段細(xì)胞陽性率，并與常規(guī)誘導(dǎo)組和單獨(dú)VEGF作用組相比較，半定量RT-PCR分析各組細(xì)胞Notch信號(hào)靶基因Hes1mRNA和p38αmRNA表達(dá)。 結(jié)果hESCs經(jīng)由EB誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干細(xì)胞過程中，γ-分泌酶抑制劑預(yù)處理組與常規(guī)誘導(dǎo)組神經(jīng)干細(xì)胞的陽性率無明顯差異，p38 MAPK抑制劑預(yù)處理組的神經(jīng)干細(xì)胞比例與VEGF組無明顯差異；RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，VEGF作用組Hes1mRNA的表達(dá)強(qiáng)于γ-分泌酶抑制劑預(yù)處理組和常規(guī)誘導(dǎo)組，MTT檢測VEGF作用組細(xì)胞增殖活性最強(qiáng)。在NSCs進(jìn)一步分化為神經(jīng)元中，γ-分泌酶抑制劑預(yù)處理組和VEGF作用組的神經(jīng)元陽性率無明顯差異；p38 MAPK抑制劑預(yù)處理組與常規(guī)誘導(dǎo)組的神經(jīng)元比例無明顯差異，RT-PCR分析顯示，VEGF作用組p38αmRNA表達(dá)高于p38 MAPK抑制劑預(yù)處理組和常規(guī)誘導(dǎo)組。 結(jié)論VEGF通過激活Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)人胚胎干細(xì)胞經(jīng)EB分化為神經(jīng)干細(xì)胞。Notch信號(hào)抑制劑可以拮抗這一過程中VEGF的作用，而p38 MAPK與這一過程無明顯相關(guān)。在人神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)元中，VEGF經(jīng)由p38 MAPK途徑，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞更多的分化為神經(jīng)元。p38 MAPK抑制劑可以阻斷VEGF的這一作用，Notch信號(hào)通路對(duì)這一過程不產(chǎn)生影響。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2300323