【摘要】：[研究背景及目的] 脂多糖(1ipopolysaccharide,LPS)即革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素(endotoxin)是革蘭氏陰性細菌的細胞壁組成成分,也是引發(fā)機體炎癥的重要物質(zhì)。革蘭氏陰性細菌感染時,細菌或LPS進入血循環(huán),激活多種炎癥細胞并誘導(dǎo)釋放炎性介質(zhì),引起炎癥反應(yīng)。當(dāng)機體受到革蘭氏陰性菌的感染時,LPS作用于細胞膜受體,通過細胞內(nèi)信號級聯(lián)傳遞,使基因表達發(fā)生變化,介導(dǎo)內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞、上皮細胞等實質(zhì)細胞以及單核巨噬細胞激活,誘導(dǎo)炎癥前細胞因子、趨化因子、生長因子和其它多種因子如白細胞介素(interleukin,IL)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)等的合成和釋放,這些細胞因子可誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合癥。 腫瘤壞死因子-alpha(tumor necrosis factor factor-alpha, TNF-α)是一個多功能的細胞因子,主要介導(dǎo)免疫及炎癥反應(yīng)。在體內(nèi),坐骨神經(jīng)受損后,損傷部位的雪旺細胞被激活并產(chǎn)生TNF-α。然而,TNF-α合成的確切機制仍然不太清楚。它主要通過不同的細胞表面受體TNFR1(tumor necrosis factor receptor 1) (p55)、TNFR2 (p75)發(fā)揮它的生物學(xué)功能。 為了研究LPS是否會誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細胞分泌TNF-α,本論文采用腹腔注射和鞘內(nèi)注射LPS兩種動物模型,分別研究在全身炎癥和局部炎癥過程的早期,大鼠的脊髓或坐骨神經(jīng)中是否有TNF-α的產(chǎn)生,并進一步研究產(chǎn)生TNF-α的細胞類別。 細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)包括ERKl和ERK2,是將信號從表面受體傳導(dǎo)至細胞核的關(guān)鍵。磷酸化激活的ERK由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到核內(nèi),進而介導(dǎo)一系列轉(zhuǎn)錄因子如:ATF、NF-κB、Ap-1、c-fos和c-Jun的轉(zhuǎn)錄活化,參與細胞增殖與分化、細胞形態(tài)維持、細胞骨架的構(gòu)建、細胞凋亡和細胞的惡變等多種生物學(xué)反應(yīng)。近年一些研究表明LPS會引起痛覺過敏,而ERK信號通路在這其中的作用卻鮮有研究,本研究即采用上述兩種動物模型,對ERK信號通路是否參與大鼠炎癥過程的一系列早期信號轉(zhuǎn)導(dǎo),是否參與了TNF-α的產(chǎn)生過程進行探討,為中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥引起的疾病治療提供新的思路和依據(jù)。 [方法] 1.建立LPS致炎大鼠模型(腹腔注射和鞘內(nèi)注射)。 2.運用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)分別檢測脊髓和坐骨神經(jīng)中TNF-α表達的時程變化;運用免疫熒光雙標(biāo),觀察TNF-α在脊髓和坐骨神經(jīng)中的細胞定位。 3.采用Western blot檢測脊髓中磷酸化ERK(pERK)和總ERK的表達變化;運用免疫組化,觀察pERK的表達部位;用免疫熒光雙標(biāo)檢測pERK在脊髓中的細胞定位。 [結(jié)果] 1. 1)在腹腔注射LPS致傷大鼠的早期,TNF-α在坐骨神經(jīng)中反應(yīng)性表達上調(diào),且主要表達于雪旺氏細胞和巨噬細胞中。 2)正常狀態(tài)下,TNF-α在大鼠脊髓中有少量表達。LPS腹腔注射后,TNF-α在脊髓灰質(zhì)的神經(jīng)元和白質(zhì)的小膠質(zhì)細胞中表達上調(diào)。 3)在鞘內(nèi)注射LPS,造成大鼠的早期致傷,TNF-α在脊髓中表達上調(diào),主要高表達于后角注射側(cè)的小膠質(zhì)細胞,而對側(cè)則無表達。 2. 1)在LPS腹腔注射的早期,pERK蛋白水平快速上調(diào),在1 h即達高峰,在12 h后逐漸降低,但總ERK的水平?jīng)]有明顯的變化。免疫組化結(jié)果表明,p-ERK主要表達于膠質(zhì)細胞中,免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果進一步證實,pERK主要表達于脊髓前角、后角、中央孔和后索部分的小膠質(zhì)細胞中。 2)pERK在鞘內(nèi)注射LPS的早期開始上調(diào),4h達到高峰。免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果表明pERK主要表達于注射側(cè)被活化的小膠質(zhì)細胞中,而對側(cè)則很少。 [結(jié)論] 1.正常狀態(tài)下,TNF-α在坐骨神經(jīng)和脊髓中表達都比較少。LPS作用后TNF-α反應(yīng)性表達水平和活性均發(fā)生改變,提示TNF-α作為一種炎癥反應(yīng)因子,參與外周神經(jīng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)。 2.細菌性致病因子LPS的誘導(dǎo)確能促進外周神經(jīng)系統(tǒng)的雪旺氏細胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細胞高效表達和炎性細胞因子TNF-α的分泌,為雪旺氏細胞作為免疫活性細胞在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用提供初步依據(jù),進一步肯定了小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的免疫調(diào)節(jié)細胞。 3.在全身炎癥過程中,ERK信號通路參與脊髓中細胞信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,且主要表達于小膠質(zhì)細胞。LPS注射后pERK在脊髓小膠質(zhì)細胞中時程式的表達增加,表明ERK這條信號通路參與小膠質(zhì)細胞的炎癥應(yīng)答過程。 4.在鞘內(nèi)注射LPS致炎的大鼠模型中,TNF-α和pERK都主要表達于注射側(cè)的小膠質(zhì)細胞,提示ERK信號通路可能參與細胞因子TNF-α的產(chǎn)生,小膠質(zhì)細胞是這一過程中主要的效應(yīng)細胞。
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【學(xué)位授予單位】：南通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R364.5

【引證文獻】

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本文編號：2299358