【摘要】： 第一部分酶切位點(diǎn)缺失的跨膜型TNF-α突變體的構(gòu)建及其功能的研究 跨膜型TNF-α(Transmembrane TNFα，tmTNF-α)是sTNF-α的前體，分子量為26kD，主要表達(dá)在活化的單核細(xì)胞和免疫細(xì)胞表面。tmTNF-α在N端比sTNF-α多76個(gè)氨基酸組成的引導(dǎo)肽，具有疏水區(qū)，故可跨膜成為膜分子。表達(dá)于細(xì)胞膜表面的tmTNF-α在TNF轉(zhuǎn)化酶(TACE／ADAM17)的作用下，被剪切釋放出sTNF-α。 由于tmTNF-α可被剪切成sTNF-α，為了排除sTNF-α的影響，在研究tmTNF-α生物學(xué)功能的時(shí)候需要用其酶切位點(diǎn)缺失的突變體。常用的缺失1-12位的突變體雖然基本不被TACE剪切，但是其正向信號(hào)介導(dǎo)的胞毒效應(yīng)下降，反向信號(hào)傳遞缺陷，故不是一個(gè)理想的研究tmTNF-α的突變體。有報(bào)道稱△1-9，K11E突變體也不被TACE剪切，并且其胞毒效應(yīng)和野生型tmTNF-α一致，但是這種突變是否影響tmTNF-α反向信號(hào)尚不清楚。 本研究通過(guò)定點(diǎn)突變的方法，將tmTNF-α的酶切作用位點(diǎn)缺失，使得tmTNF-α不被剪切為sTNFα；并研究突變體對(duì)正反向信號(hào)的影響。主要結(jié)果如下： 1利用重疊PCR技術(shù)，成功構(gòu)建△1-12tmTNF-α、△1-9，K11E tmTNF-α突變體，經(jīng)酶切鑒定，PCR鑒定及測(cè)序鑒定確認(rèn)除預(yù)期突變外，無(wú)任何其它點(diǎn)突變，移碼及缺失突變。 2將tmTNF-α及其突變體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后，經(jīng)Western blot鑒定wt tmTNF-α在26kD處有特異性條帶，突變體在25kD左右有特異性條帶，符合預(yù)期分子量。 3用野生型tmTNF-α及其突變體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，證實(shí)轉(zhuǎn)染野生型tmTNF-α的細(xì)胞能分泌大量的sTNF-α，而轉(zhuǎn)染△1-12 tmTNF-α和△1-9，K11E tmTNF-α突變體的細(xì)胞上清均未檢測(cè)到sTNF-α，提示兩個(gè)缺失突變體都喪失被TACE酶解為sTNF-α的能力。 4用生物活性檢測(cè)證實(shí)wt tmTNF-α和△1-9，K11E tmTNF-α對(duì)靶細(xì)胞有明顯的殺傷作用；但是△1-12 tmTNF-α的胞毒效應(yīng)卻減少了近一半，說(shuō)明△1-9，K11E tmTNF-α保留了野生型tmTNF-α正向信號(hào)介導(dǎo)的胞毒效應(yīng)。 5用Western blot檢測(cè)證實(shí)△1-9，K11E tmTNF-α與wt tm TNF-α一樣能通過(guò)其反向信號(hào)有效降解IκB-α，激活NF-κB，而△1-12tmTNF-α則失去了這種能力。上述結(jié)果表明△1-9，K11E tmTNF-α突變體既喪失被酶解的能力，又能保留野生型tmTNF-α正向信號(hào)和反向信號(hào)傳遞能力，為進(jìn)一步研究tmTNF-α的生物學(xué)功能提供了有力的工具。 第二部分脂筏與tmTNF-α的正／反向信號(hào) 脂筏是近年被發(fā)現(xiàn)的存在于細(xì)胞膜上微結(jié)構(gòu)域，區(qū)別于經(jīng)典的胞膜脂質(zhì)雙分子層，它富含膽固醇、磷脂酰肌醇。已知很多受體及其相關(guān)的信號(hào)分子均能分布在脂筏內(nèi)。由于脂筏在質(zhì)膜上分布比較分散，且能側(cè)向漂移和聚集，故可形成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)平臺(tái)，參與活化受體募集信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，向胞內(nèi)傳遞信號(hào)。 tmTNF-α不僅能和受體結(jié)合，向靶細(xì)胞傳遞正向信號(hào)，本身還能作為受體，用其胞內(nèi)段募集信號(hào)分子，傳遞反向信號(hào)。有報(bào)道tmTNF-α的-47位半胱氨酸是棕櫚�；；稽c(diǎn)，故我們推測(cè)tmTNF-α可能定位在脂筏中，但是tmTNF-α與脂筏的關(guān)系尚不清楚。此外，TNFR也能定位在脂筏，脂筏內(nèi)外的TNFR與tmTNF-α之間的關(guān)系也不清楚。 為闡明tmTNF-α與脂筏的關(guān)系，我們利用蔗糖密度梯度離心法提取脂筏結(jié)構(gòu)，明確tmTNF-α的脂筏定位；并從表達(dá)tmTNF-α的效應(yīng)細(xì)胞和表達(dá)TNFR的靶細(xì)胞兩方面入手，研究脂筏在tmTNF-α正反向信號(hào)傳導(dǎo)中的作用。其主要結(jié)果如下： 1脂筏與tmTNF-α反向信號(hào) 1．1 tmTNF-α可定位脂筏內(nèi)：利用蔗糖密度梯度離心法分離高表達(dá)tmTNF-α的Raji細(xì)胞的脂筏結(jié)構(gòu)，用Western blot檢測(cè)證實(shí)部分tmTNF-α定位在脂筏內(nèi)。用10mMMCD破壞脂筏，所有tmTNF-α均分布到脂筏外。 1．2脂筏內(nèi)tmTNF-α導(dǎo)致sTNF-α耐受：高表達(dá)tmTNF-α的Raji細(xì)胞對(duì)sTNF-α耐受，用MCD破壞脂筏后對(duì)sTNF-α胞毒效應(yīng)的敏感性明顯增加；而低表達(dá)tmTNF-α的T24細(xì)胞對(duì)sTNF-α敏感，脂筏破壞后，sTNF-α的胞毒效應(yīng)也明顯增強(qiáng)。提示定位在脂筏內(nèi)的tmTNF-α可導(dǎo)致sTNF-α耐受 1．3破壞脂筏導(dǎo)致NF-κB活性下降：高表達(dá)tmTNF-α的Raji細(xì)胞經(jīng)MCD處理后，IκB-α降解明顯受到抑制；而低表達(dá)tmTNF-α的T24細(xì)胞經(jīng)MCD處理后，IκB-α水平則無(wú)明顯變化。提示破壞脂筏能使tmTNF-α反向信號(hào)減弱。 1．4建立穩(wěn)轉(zhuǎn)完全定位在脂筏內(nèi)或外的tmTNF-α突變體的細(xì)胞株：利用重組PCR成功構(gòu)建cav-tmTNF-α和C-47A tmTNF-a突變體，連同野生型tmTNF-a穩(wěn)轉(zhuǎn)T24細(xì)胞。提取脂筏分析證實(shí)cav-tmTNF-α完全定位于脂筏內(nèi)，而C-47A tmTNF-a則完全定位于脂筏外。 1．5脂筏內(nèi)tmTNF-α誘導(dǎo)對(duì)sTNF-α胞毒效應(yīng)的耐受：用胞毒實(shí)驗(yàn)證實(shí)sTNF-α可有效殺傷定位在脂筏外的C-47A tmTNF-α表達(dá)細(xì)胞，而對(duì)部分定位脂筏內(nèi)的wttmTNF-α表達(dá)細(xì)胞的胞毒效應(yīng)則明顯下降。提示只有脂筏內(nèi)的tmTNF-α才可導(dǎo)致細(xì)胞抵抗sTNF-α的胞毒效應(yīng)。 1．6脂筏內(nèi)tmTNF-α可組成性活化NF-κB：Western blot證實(shí)部分定位脂筏內(nèi)的wttmTNF-α可組成性降解IκB-α，使NF-κB p65磷酸化；而僅在脂筏外的C-47AtmTNF-α則無(wú)此作用。 1．7脂筏內(nèi)tmTNF-α可上調(diào)抗凋亡分子cIAP1基因表達(dá)，下調(diào)促凋亡分子Bax基因表達(dá)：用Real time PCR檢測(cè)證實(shí)部分定位在脂筏內(nèi)的wt tmTNF-α誘導(dǎo)cIAP1基因表達(dá)明顯增加，卻明顯抑制Bax的基因轉(zhuǎn)錄；但是定位在脂筏外的C-47AtmTNF-α則無(wú)明顯影響。 1．8 CKI抑制劑D4476可增強(qiáng)脂筏內(nèi)tmTNF-α對(duì)sTNF-α的抵抗：用CKI的特異性抑制劑抑制tmTNF-α的磷酸化，增強(qiáng)反向信號(hào)，結(jié)果可增強(qiáng)轉(zhuǎn)染wt tmTNF-α細(xì)胞對(duì)sTNF-α胞毒效應(yīng)的抵抗，卻對(duì)sTNF-α殺傷定位在脂筏外的C-47A tmTNFα表達(dá)細(xì)胞則無(wú)明顯作用。提示tmTNFα誘導(dǎo)的sTNF-α耐受是由定位在脂筏內(nèi)的tmTNF-α通過(guò)其反向信號(hào)介導(dǎo)的。 1．9 tmTNF-α以脂筏為平臺(tái)傳遞反向信號(hào)：用可溶性TNF受體刺激tmTNF-α反向信號(hào)或轉(zhuǎn)染定位脂筏內(nèi)、外的tmTNF-α及其突變體證明激活tmTNF-α可導(dǎo)致該分子本身向脂筏內(nèi)聚集，且募集其反向信號(hào)分子TRAF1、IKK-α和NF-κBp52至脂筏內(nèi)；而定位在脂筏外的C-47A tmTNF-α則對(duì)這些信號(hào)分子脂筏內(nèi)外的分布無(wú)影響。提示tmTNF-α可能是以脂筏為平臺(tái)傳遞反向信號(hào)的。 2脂筏與tmTNF-α正向信號(hào) 2．1效應(yīng)細(xì)胞脂筏對(duì)tmTNF-α正向信號(hào)介導(dǎo)的生物學(xué)功能的影響 2．1．1 tmTNF-α胞毒效應(yīng)與其定位脂筏內(nèi)外無(wú)關(guān)：用MCD破壞Raji細(xì)胞的脂筏，發(fā)現(xiàn)與TNF抗體封閉一樣，幾乎可以完全阻斷tmTNF-α對(duì)T24細(xì)胞的胞毒效應(yīng)。但是，轉(zhuǎn)染野生型tmTNF-α、完全定位在脂筏外的C-47A tmTNF-a突變體或完全定位在脂筏內(nèi)的cav-tmTNF-α突變體的效應(yīng)細(xì)胞都具有相似的胞毒效應(yīng)，三者間無(wú)明顯差異，提示效應(yīng)細(xì)胞脂筏內(nèi)外的tmTNF-α均可有效殺傷靶細(xì)胞，即tmTNF-α殺傷靶細(xì)胞與其是否定位脂筏無(wú)關(guān)。 2．1．2破壞ICAM-1脂筏定位抑制效靶細(xì)胞粘附，，從而阻斷tmTNF-α胞毒效應(yīng)：用MCD破壞脂筏則所有ICAM-1分布至脂筏外，效／靶細(xì)胞粘附下降，tmTNF-α胞毒作用幾乎被完全阻斷，而ICAM-1中和抗體可部分抑制效／靶細(xì)胞之間的粘附，并部分阻斷tmTNF-α胞毒作用。提示MCD阻斷tmTNF-α胞毒效應(yīng)是由于破壞粘附分子脂筏定位，進(jìn)而抑制效／靶細(xì)胞粘附所致。 2．1．3破壞脂筏導(dǎo)致sTNF-α分泌增加：用MCD破壞Raji細(xì)胞的脂筏，可導(dǎo)致部分本來(lái)分布在脂筏內(nèi)的TACE轉(zhuǎn)至脂筏外，sTNF-α產(chǎn)生明顯增加。 2．2靶細(xì)胞脂筏對(duì)tmTNF-α正向信號(hào)介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)的影響 2．2．1 tmTNF-α刺激誘導(dǎo)靶細(xì)胞TNFR1向脂筏內(nèi)聚集：用固定的高表達(dá)tmTNF-α的Raji細(xì)胞作用于T24細(xì)胞，可見T24細(xì)胞大量TNFR1從脂筏外轉(zhuǎn)移至脂筏內(nèi)，此結(jié)果提示TNFR定位在脂筏可能影響tmTNF-α的正向信號(hào)。 2．2．2 sTNF-α及脂筏內(nèi)外的tmTNF-α對(duì)靶細(xì)胞脂筏內(nèi)外TNFR1的作用：用MCD破壞靶細(xì)胞脂筏導(dǎo)致sTNF-α胞毒效應(yīng)顯著增加，卻明顯抑制wt tmTNF-α、C-47AtmTNF-α和cav-tmTNF-α的殺傷作用，并且三者間沒(méi)有明顯差異。提示靶細(xì)胞脂筏在sTNF-α和tmTNF-α的胞毒效應(yīng)中所起作用不同，而效應(yīng)細(xì)胞脂筏則與tmTNF-α正向信號(hào)無(wú)關(guān)。 本研究證實(shí)tmTNF-α能定位在脂筏，且依賴于其-47位半胱氨酸。tmTNF-α的反向信號(hào)傳遞依賴其脂筏定位；而tmTNF-α正向信號(hào)傳遞則與效應(yīng)細(xì)胞脂筏無(wú)關(guān)，卻與靶細(xì)胞TNFR的脂筏定位相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 羅小林;何芳;;STIM1及其相關(guān)蛋白在脂筏介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)中的作用機(jī)制[J];國(guó)際病理科學(xué)與臨床雜志;2011年03期

2 吳寒宇;黃紅蘭;;脂筏及其在病原生物感染中的作用概述[J];中國(guó)病原生物學(xué)雜志;2011年06期

3 王立偉;朱林燕;王躍春;王子棟;;神經(jīng)傳導(dǎo)的新概念:無(wú)動(dòng)作電位的興奮傳導(dǎo)[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2011年04期

4 ;[J];;年期

5 ;[J];;年期

6 ;[J];;年期

7 ;[J];;年期

8 ;[J];;年期

9 ;[J];;年期

10 ;[J];;年期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 王麗芬;甄宏濤;姚琬靜;卞芳;周帆;毛曉芳;姚平;金肆;;脂筏介導(dǎo)的雙氧化酶1-過(guò)氧化氫-核因子κB信號(hào)通路[A];中國(guó)藥理學(xué)會(huì)第十一次全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議�？痆C];2011年

2 趙玉峰;劉朝英才;夏泉;徐躍飛;馬克里;;脂筏與非脂筏質(zhì)膜微域磷脂組份及結(jié)構(gòu)的比較分析[A];2008年全國(guó)糖生物學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要[C];2008年

3 劉濤;張述;尹丙姣;王晶;李卓婭;;脂筏參與跨膜TNF-α的胞毒效應(yīng)[A];第六屆全國(guó)免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2008年

4 陳克清;劉濤;于敏;尹丙姣;王晶;李卓婭;;脂筏在tmTNF-a反向信號(hào)傳遞中的作用[A];中國(guó)病理生理學(xué)會(huì)受體、腫瘤和免疫專業(yè)委員會(huì)聯(lián)合學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2010年

5 呂繼華;何立;謝鑫;周慶華;陳果;隋森芳;;SynaptotagminⅠ蛋白與脂筏的結(jié)合[A];第十次中國(guó)生物物理學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要集[C];2006年

6 歐陽(yáng)靜萍;;質(zhì)膜微囊(Caveolae)與疾病[A];湖北省暨武漢市病理生理學(xué)會(huì)第十二屆學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2004年

7 郁毅剛;徐如祥;姜曉丹;柯以銓;蔡穎謙;姚謙明;丁漣沭;;神經(jīng)細(xì)胞膜NMDAR蛋白單分子原子力顯微鏡系列初步研究[A];中國(guó)神經(jīng)科學(xué)學(xué)會(huì)第六屆學(xué)術(shù)會(huì)議暨學(xué)會(huì)成立十周年慶祝大會(huì)論文摘要匯編[C];2005年

8 吳文杰;陽(yáng)喬;曹芹芳;張耀文;唐望先;;FAAH對(duì)內(nèi)源性大麻素作用肝細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制研究[A];第十八次全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合肝病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

9 鐘建;沙印林;;脂筏模型膜系統(tǒng)的建立[A];中國(guó)科協(xié)2005年學(xué)術(shù)年會(huì)生物物理與重大疾病分會(huì)論文摘要集[C];2005年

10 何會(huì);葉紅;金肆;馬萬(wàn)里;呂麗華;劉聲遠(yuǎn);王迪潯;胡清華;;脂筏聚集及其與CaSR,FKBP12.6的共定位在哮喘細(xì)胞因子所致氣道上皮細(xì)胞鈣振蕩中的作用[A];湖北省暨武漢市病理生理學(xué)會(huì)第十四屆學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2008年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 劉濤;脂筏對(duì)tmTNF-α雙向信號(hào)影響的研究[D];華中科技大學(xué);2009年

2 張婷;基于生物分子網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞脂筏和TRAIL信號(hào)通路的研究[D];清華大學(xué);2011年

3 閔一帆;脂筏在TRAIL引起的細(xì)胞凋亡早期事件中的作用研究[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2007年

4 黃紅蘭;脂筏在人類皰疹病毒6型裝配中的作用及對(duì)病毒感染的影響[D];吉林大學(xué);2006年

5 朱勇U

本文編號(hào)：2297681