【摘要】： 第一章小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的體外分離擴(kuò)增及鑒定 目的探討小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(marrow mesenchymal stem cells MSCs)體外分離、純化及鑒定的方法。 方法采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)小鼠MSCs,觀察不同代細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)情況,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面抗原CD34、CD45、CD105和CD106的表達(dá)情況,并對(duì)小鼠MSCs進(jìn)行純度測(cè)定。 結(jié)果：小鼠MSCs原代培養(yǎng)接種24小時(shí)后僅可見少許細(xì)胞貼壁,72小時(shí)后貼壁細(xì)胞數(shù)量逐漸增多,可見一些集落形成,此時(shí)貼壁的細(xì)胞形態(tài)為長(zhǎng)梭形。在細(xì)胞培養(yǎng)的2-6天細(xì)胞增殖較慢,7-12天細(xì)胞增殖較快,呈“旋渦樣”排列。細(xì)胞培養(yǎng)約兩周左右,可接近80%-90%融合,細(xì)胞形態(tài)較為均一。傳代后的小鼠MSCs24小時(shí)基本全部貼壁,呈梭形或星型樣形態(tài),傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞不再以集落方式生長(zhǎng),而呈均勻性分布生長(zhǎng)。分離純化后所得細(xì)胞活力為92.6±1.8%。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示第3代小鼠MSCs細(xì)胞均一性較好,在90%以上；CD34、CD45表達(dá)陰性,CD105、CD106表達(dá)陽性。結(jié)論：密度梯度離心法結(jié)合貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法可成功培養(yǎng)出MSCs,所得小鼠MSCs活力及純度均較高,流式細(xì)胞技術(shù)可以鑒定體外分離培養(yǎng)的小鼠MSCs。 第二章肺組織與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外非接觸共培養(yǎng) 目的建立肺組織與MSCs體外非接觸共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?探討高氧損傷肺組織體外對(duì)MSCs分化及遷移能力的影響。 方法出生1天新生小鼠置于60%氧濃度條件下飼養(yǎng)21天,建立支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia BPD)肺損傷模型。21天時(shí)脫頸椎處死取出肺組織,無菌條件下研磨、篩網(wǎng)過濾、胰酶消化、制備成肺組織單細(xì)胞懸液。共設(shè)定3組,transwell小室(PET膜孔徑為0.4um)下室中為第三代小鼠MSCs,上室中分別隨機(jī)放入高氧損傷肺組織單細(xì)胞懸液(實(shí)驗(yàn)組A)、正常肺組織單細(xì)胞懸液(實(shí)驗(yàn)組B)及空白培養(yǎng)液(對(duì)照組),進(jìn)行體外非接觸共培養(yǎng)。共培養(yǎng)6天做劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn),觀察共培養(yǎng)后各組MSCs遷移能力的變化。共培養(yǎng)8天進(jìn)行免疫熒光染色,激光共聚焦顯微下觀察各組共培養(yǎng)體系下室SP-C、AQP5免疫熒光表達(dá)情況。共培養(yǎng)8天采用實(shí)時(shí)定量(Real-time)PCR,2-△△Ct方法定量分析共培養(yǎng)體系下室MSCs中表面活性蛋白-C(SP-C)、水通道蛋白5(AQP5)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)mRNA含量的表達(dá)。 結(jié)果吸入60%氧氣21天小鼠肺組織病理切片示：肺泡正常結(jié)構(gòu)消失,肺泡腔直徑明顯擴(kuò)大,肺泡數(shù)量減少,可見大面積肺泡融合,肺泡間隔增厚,大量間質(zhì)細(xì)胞增生,BPD高氧肺損傷模型建立成功。劃痕后培養(yǎng)12小時(shí)進(jìn)行觀察,三組均僅有少量細(xì)胞爬行至劃痕中,24小時(shí)三組數(shù)目均有增加,但實(shí)驗(yàn)組A增加較明顯,48小時(shí)實(shí)驗(yàn)組B及對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)量明顯少于實(shí)驗(yàn)組A。Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)48小時(shí)后,對(duì)小室下表面上的細(xì)胞計(jì)數(shù),發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組A與實(shí)驗(yàn)組B或?qū)φ战M相比較,穿過PET膜的細(xì)胞數(shù)目均有顯著性差異。提示損傷肺組織共培養(yǎng)可以促進(jìn)MSCs遷移能力的提高。共培養(yǎng)8天時(shí)免疫熒光結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組A組可以見hoechst33342標(biāo)記的藍(lán)色熒光,AQP5的紅色熒光, SP-C的綠色熒光；實(shí)驗(yàn)組B和對(duì)照組都僅見到hoechst33342標(biāo)記的藍(lán)色熒光,AQP5的紅色熒光,而未見到SP-C的綠色熒光。共培養(yǎng)8天時(shí)Real-timePCR結(jié)果：SP-CmRNA在實(shí)驗(yàn)組A存在表達(dá),但實(shí)驗(yàn)組B和對(duì)照組均未見有SP-CmRNA表達(dá)。AQP5mRNA、TGF-β1mRNA三組均有表達(dá),實(shí)驗(yàn)組A與實(shí)驗(yàn)組B和對(duì)照組比較AQP5、TGF-β1mRNA的表達(dá)水平明顯增加(P0.01)。但實(shí)驗(yàn)組B組與對(duì)照組表達(dá)水平無明顯差異(P0.05)。 結(jié)論成功建立BPD高氧肺損傷模型,以及體外非接觸共培養(yǎng)誘導(dǎo)小鼠MSCs分化為肺泡上皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?并證實(shí)與損傷肺組織共培養(yǎng)后MSCs的體外遷移能力增強(qiáng),損傷的肺組織可以促進(jìn)小鼠MSCs誘導(dǎo)分化為肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(alveolar epithelial typeⅡcell AECⅡ)
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【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2297387