【摘要】： 隱孢子蟲(Cryptosporidium)是一種寄生性原蟲,主要寄生于人和其他哺乳動物的胃腸道、禽類的呼吸道等粘膜上皮細(xì)胞內(nèi),引起隱孢子蟲病。該病分布廣泛,人畜感染率高,且危害嚴(yán)重,臨床上以嚴(yán)重水樣腹瀉為主要特征。目前已有200余種藥物被試用于治療該病,但尚無特效藥物。有學(xué)者通過對隱孢子蟲亞單位疫苗及核酸疫苗的研究認(rèn)為有效的疫苗對該病的防治具有一定的作用,關(guān)鍵在于選擇有效的疫苗候選抗原。Rhomboid蛋白是頂器門原蟲侵入與粘附宿主細(xì)胞的重要蛋白,有望成為疫苗的候選抗原。為探討微小隱孢子蟲Rhomboid基因?qū)ξ⑿‰[孢子蟲感染的免疫保護(hù)力,本試驗利用生物信息學(xué)技術(shù)從微小隱孢子蟲基因組cDNA中預(yù)測Rhomboid基因開放閱讀框,設(shè)計引物,從微小隱孢子蟲長春株總RNA中擴(kuò)增出Rhomboid基因,將其克隆入原核表達(dá)載體并表達(dá)出微小隱孢子蟲重組Rhomboid蛋白,利用間接免疫熒光技術(shù)對該蛋白進(jìn)行抗原定位;同時用DNA重組技術(shù)將微小隱孢子蟲Rhomboid基因克隆入真核表達(dá)載體構(gòu)建核酸疫苗,將所構(gòu)建的微小隱孢子蟲Rhomboid重組蛋白與核酸疫苗分別免疫小鼠檢測其免疫保護(hù)力。結(jié)果顯示:擴(kuò)增出1395bp的開放閱讀框,經(jīng)Blast比對顯示核苷酸和氨基酸的同源性分別為99.9%和99.6%。并表達(dá)出51KDa的重組融合蛋白,Western blot試驗證實所得蛋白具有反應(yīng)原性,間接免疫熒光顯示該蛋白位于子孢子;用間接免疫熒光方法在重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的Hela細(xì)胞中檢測到特異蛋白,通過Western blot試驗證實所得蛋白具有反應(yīng)原性;重組Rhomboid蛋白免疫保護(hù)性試驗結(jié)果顯示,隨著免疫次數(shù)的增加抗體滴度逐漸增加,試驗組與對照組相比差異極顯著(P0.01)。CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)與對照組相比差異均不顯著(P0.05)。試驗組小鼠對抗微小隱孢子蟲感染具有一定保護(hù)作用,卵囊排出量明顯減少,排出時間縮短2d,減蟲率達(dá)65.48%。核酸疫苗免疫保護(hù)性試驗結(jié)果表明,試驗組與對照組相比,特異性抗體滴度顯著增加(P0.01);CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)與對照組相比差異均不顯著(P0.05)。攻蟲后試驗組小鼠卵囊排出量明顯減少,排出時間縮短2d,減蟲率達(dá)63.1%。
[Abstract]:Cryptosporidium (Cryptosporidium) is a parasitic protozoa, mainly parasitic in human and other mammalian gastrointestinal tract, poultry respiratory tract and other mucosal epithelial cells, causing Cryptosporidiosis. The disease is widely distributed, the infection rate of human and animal is high, and the harm is serious. The main clinical characteristic of the disease is severe watery diarrhea. At present, more than 200 drugs have been tested for the treatment of the disease, but there are no special drugs. Through the research of Cryptosporidium subunit vaccine and nucleic acid vaccine, some scholars think that the effective vaccine has certain effect on the prevention and cure of the disease. The key lies in the selection of effective vaccine candidate antigens. Rhomboid protein is an important protein which invades and adheres to host cells and is expected to be a candidate antigen for vaccine. In order to study the immune protection of Cryptosporidium microsporidium Rhomboid gene against Cryptosporidium minimus infection, the open reading frame of Rhomboid gene was predicted from genomic cDNA of Cryptosporidium minimus by bioinformatics technique, and primers were designed. The Rhomboid gene was amplified from the total RNA of Cryptosporidium minimus Changchun strain and cloned into prokaryotic expression vector to express the recombinant Rhomboid protein of Cryptosporidium minimus. At the same time, Rhomboid gene of Cryptosporidium minimus was cloned into eukaryotic expression vector by DNA recombination technique to construct nucleic acid vaccine. The recombinant Rhomboid protein of Cryptosporidium minimus and the nucleic acid vaccine were immunized to test the immune protection of mice. The results showed that the open reading frame of 1395bp was amplified and the homology of nucleotide and amino acid was 99.9% and 99.66% respectively by Blast comparison. The recombinant fusion protein of 51KDa was confirmed to be reactive by, Western blot assay, and the specific protein was detected by indirect immunofluorescence in Hela cells transfected with recombinant plasmid. The results of Western blot test showed that the antibody titer of recombinant Rhomboid protein increased with the increase of immunization times. Compared with the control group, the difference was very significant (P0.01). There was no significant difference in the number of CD4, CD8 T lymphocytes between the experimental group and the control group (P0.05). The mice in the test group had a protective effect against Cryptosporidium minimus infection, the oocyst excretion was obviously reduced, the excretion time was shortened by 2 days, and the worm abatement rate was 65.48. The results of immune protection test showed that the titer of specific antibody in the test group was significantly higher than that in the control group (P0.01), while the number of CD4 and CD8 T lymphocytes was not significantly different from that of the control group (P0.05). The oocyst excretion of the test group was obviously reduced, the excretion time was shortened by 2 days, and the worm reduction rate was 63.1%.
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392

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本文編號：2293191