【摘要】： 目的首先觀察大鼠Kupffer細(xì)胞與肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞體外共同培養(yǎng)時(shí)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)、形態(tài)及功能狀況,建立實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型。進(jìn)一步觀察不同濃度葡萄糖對(duì)大鼠肝細(xì)胞白蛋白基因表達(dá)的影響。方法(1)原位二步Ⅳ型膠原酶灌注法聯(lián)合Percoll液密度梯度離心法分離肝細(xì)胞與Kupffer細(xì)胞;體外進(jìn)行肝細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)、肝細(xì)胞與Kupffer細(xì)胞按6:1比例共同培養(yǎng),觀察不同情況下肝細(xì)胞生存時(shí)間和形態(tài),每隔24h檢測(cè)培養(yǎng)上清中白蛋白和ALT、AST的水平,并在36h放免法檢測(cè)上清液TNF-α、IL-1、IL-6含量。(2)用終濃度分別為3.9mmol/L,7.0mmol/L,11.1mmol/L,22.2mmol/L的葡萄糖處理聯(lián)合培養(yǎng)體系,以3.9mmol/L組作為對(duì)照組,分別于4h、24h留取細(xì)胞上清液,全自動(dòng)生化儀檢測(cè)白蛋白濃度,放免法檢測(cè)上清液TNF-α、IL-1、IL-6含量,提取肝細(xì)胞RNA及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈法(RT-PCR)檢測(cè)白蛋白mRNA含量。結(jié)果(1)單獨(dú)培養(yǎng)組肝細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖迅速,并向正常肝細(xì)胞的形態(tài)演變,肝細(xì)胞可培養(yǎng)存活至15d;共同培養(yǎng)組肝細(xì)胞細(xì)胞生長(zhǎng)增殖緩慢,細(xì)胞可培養(yǎng)存活至10d�；旌吓囵B(yǎng)組上清白蛋白水平在24、36、48、60h比單獨(dú)培養(yǎng)組低(t=2.980,3.139,2.551,2.605;p0.05);混合培養(yǎng)組上清ALT、AST水平在24、36、48、60h高于于單獨(dú)培養(yǎng)組(ALT t=3.055,2.666,2.824,3.108;p0.05;AST t=2.632,2.446,3.090,2.895;p0.05),聯(lián)合培養(yǎng)組Kupffer細(xì)胞保持IL-1、IL-6和TNF-α分泌功能,而單獨(dú)培養(yǎng)組未檢測(cè)到IL-1、IL-6和TNF-α。(2)不同濃度葡萄糖處理肝細(xì)胞4h后,各組肝細(xì)胞上清中IL-1,IL-6,TNF水平與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與此同時(shí),各組肝細(xì)胞上清中白蛋白水平與肝細(xì)胞白蛋白mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比下降不明顯;而培養(yǎng)24h以后,各組肝細(xì)胞上清中IL-1,IL-6,TNF水平與對(duì)照組相比上升明顯,并且,隨著葡萄糖濃度的增加肝細(xì)胞上清中IL-1,IL-6,TNF濃度不斷上升,并且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系,各組肝細(xì)胞上清中白蛋白水平與肝細(xì)胞白蛋白mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比下降明顯,呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系,與肝細(xì)胞上清中IL-1,IL-6,TNF水平變化一致。結(jié)論(1)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)條件下可進(jìn)行共同培養(yǎng),kupffer細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的功能和肝細(xì)胞白蛋白合成分泌功能保持良好,可用于實(shí)驗(yàn)研究。(2)高濃度葡萄糖糖能促進(jìn)Kupffer細(xì)胞釋放IL-1、IL-6和TNF-α,間接抑制大鼠肝細(xì)胞白蛋白mRNA的表達(dá)。
[Abstract]:Objective to observe the growth, morphology and function of rat Kupffer cells and hepatic parenchymal cells in vitro. To investigate the effect of glucose concentration on the expression of albumin gene in rat hepatocytes. Methods (1) Hepatocytes and Kupffer cells were isolated by in situ two-step collagenase perfusion combined with Percoll liquid density gradient centrifugation. Hepatocytes were cultured separately in vitro and co-cultured with Kupffer cells at 6:1. The survival time and morphology of hepatocytes were observed under different conditions. The levels of albumin and ALT,AST in supernatants were detected every 24 hours, and the contents of TNF- 偽 and IL-1,IL-6 in supernatants were detected by radioimmunoassay at 36h. (2) the co-culture system was treated with glucose with final concentration of 3.9mmol / L 7.0mmol / L 11.1mmol 路L ~ (-1) 路L ~ (-2) mmol 路L ~ (-1) 路L ~ (-1) glucose. 3.9mmol/L group was used as control group. The supernatant was collected at 4 h or 24 h. The concentration of albumin was detected by automatic biochemical instrument, the content of TNF- 偽 and IL-1,IL-6 in supernatant was detected by radioimmunoassay, the content of albumin mRNA was detected by RNA extraction from hepatocytes and by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). Results (1) the growth and proliferation of hepatocytes in the single culture group were rapid, and the morphology of the hepatocytes evolved to normal. The hepatocytes could survive to 15 days, while the co-cultured group could grow slowly, and the cells could survive to 10 days. The supernatant albumin level in the mixed culture group was lower than that in the single culture group for 60 h (t2.980,3.139U 2.139U 2.551U 2.605p0.05), and the ALT,AST level in the supernatant of the mixed culture group was higher than that in the single culture group (ALT t3.0552.6662.8243.108p0.05), and the Kupffer cells in the co-culture group maintained the function of IL-1,IL-6 and TNF- 偽 secretion. However, there was no IL-1,IL-6 and TNF- 偽. (2) after 4 hours of glucose treatment, the level of IL-1,IL-6,TNF in the supernatant of hepatocytes in each group was not significantly different from that in the control group, and at the same time, there was no significant difference between the two groups. The levels of albumin in the supernatant of hepatocytes and the expression of albumin mRNA in the hepatocytes of each group were not significantly decreased compared with those of the control group, but after 24 hours of culture, the level of IL-1,IL-6,TNF in the supernatant of hepatocytes in each group was significantly higher than that in the control group. The concentration of IL-1,IL-6,TNF in the supernatant of hepatocytes increased with the increase of glucose concentration, and showed a dose-dependent relationship. The levels of albumin in the supernatants and the expression of albumin mRNA in hepatocytes decreased significantly in each group compared with those in the control group. There was a dose-dependent relationship, which was consistent with the change of IL-1,IL-6,TNF level in the supernatant of hepatocytes. Conclusion (1) Hepatic parenchymal cells and Kupffer cells can be co-cultured under suitable culture conditions. The function of cytokines secreted by kupffer cells and the synthesis and secretion of albumin in hepatocytes remain good. (2) High concentration glucose could promote the release of IL-1,IL-6 and TNF- 偽 from Kupffer cells and indirectly inhibit the expression of albumin mRNA in rat hepatocytes.
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R329

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