【摘要】： 結(jié)核病(Tuberculosis, TB)由來已久,自有人類歷史記錄開始,就有了TB的記錄。迄今為止,約2億人被TB奪去生命,而這個(gè)數(shù)字仍在上升,世界衛(wèi)生組織宣布TB是人類目前面臨的最大威脅之一。1882年,Robert Koch證實(shí)了結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)是TB的病原。全世界已有1/3人口約20億人感染了MTB,現(xiàn)有結(jié)核病人2千萬,每年新發(fā)病人數(shù)約880萬,每年死亡人數(shù)高達(dá)160萬。目前廣泛用于預(yù)防TB的唯一疫苗是卡介苗(Bacille Calmette Guérin, BCG),但其免疫保護(hù)效果對(duì)于肺結(jié)核及彌散性結(jié)核分別約為50%和80%,存在顯著差異。TB野毒株的高度耐藥以及與人免疫缺陷病毒( Human immunodeficiency virus,HIV)共感染的不斷上升,使TB警戒再次升高,并強(qiáng)調(diào)要利用免疫手段來控制TB的感染和傳播。 TB特異性免疫應(yīng)答在清除MTB感染中發(fā)揮重要作用。BCG對(duì)青少年TB的預(yù)防具有重要的作用,但對(duì)于成人肺結(jié)核的保護(hù)作用有限,因此在設(shè)計(jì)新型抗結(jié)核疫苗時(shí)要考慮到如何預(yù)防肺結(jié)核�；蚪M學(xué)比較分析顯示BCG中要比MTB缺失約100多個(gè)編碼序列,其中的一些序列編碼重要的抗原,當(dāng)這些抗原被重新重組入BCG中都能夠增強(qiáng)抗結(jié)核的能力。BCG中缺失RD1(Regions of difference 1),而RD1中的編碼基因esxB和esxA基因分別編碼培養(yǎng)濾液蛋白10(Culture filter protein 10, CFP-10)和早期分泌抗原靶6(Earlier secreted antigen target 6, ESAT-6),它們僅存在于臨床分離的致病性MTB及牛分枝桿菌野毒株(M. bovis),能夠誘導(dǎo)有效的Th1應(yīng)答,并在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中顯示其對(duì)TB的保護(hù)效力,因而成為TB免疫診斷以及疫苗研究中最有力的候選抗原。為此,本研究以沙門菌及其鞭毛蛋白為載體,原核表達(dá)并運(yùn)送ESAT-6、CFP-10蛋白,經(jīng)滴鼻免疫,探討了MTB保護(hù)性抗原ESAT-6和CFP-10蛋白誘導(dǎo)的黏膜免疫機(jī)理。 1.結(jié)核分枝桿菌ESAT-6、CFP-10蛋白的克隆、表達(dá)及免疫原性分析 為分析結(jié)核分枝桿菌分泌性抗原ESAT-6和CFP-10蛋白的免疫原性,利用PCR擴(kuò)增了ESAT-6、CFP-10編碼基因,經(jīng)克隆篩選和測(cè)序鑒定后,構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pBCX-esat及pET-cfp。將兩質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3),進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE分析結(jié)果表明,重組的ESAT-6和CFP-10蛋白均獲表達(dá),融合蛋白的大小分別約為39kD和19kD。將CFP-10與本室研制的針對(duì)CFP-10蛋白的單克隆抗體6E8進(jìn)行Western-blotting分析。結(jié)果顯示,CFP-10融合蛋白能與特異性單克隆抗體6E8反應(yīng)。同時(shí),在ELISA實(shí)驗(yàn)中,重組ESAT-6蛋白與醫(yī)院結(jié)核病人血清呈陽性反應(yīng)。將ESAT-6及CFP-10融合蛋白分別以腹腔注射免疫C57BL/6小鼠,并于第二次免疫后7d,取小鼠脾臟細(xì)胞,用胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法檢測(cè)ESAT-6及CFP-10蛋白特異性CD4+ T細(xì)胞分泌的IFN-γ及IL-4。結(jié)果兩組蛋白均能誘導(dǎo)較高水平的IFN-γ,而IL-4水平低于IFN-γ水平。此外,經(jīng)檢測(cè)脾臟中CD3+ T細(xì)胞的CD69分子表達(dá)發(fā)現(xiàn),ESAT-6和CFP-10蛋白免疫組的CD69水平顯著上調(diào)。從而說明重組ESAT-6和CFP-10蛋白具有良好的免疫原性;免疫小鼠后,能夠激活CD3+ T細(xì)胞,并誘導(dǎo)以細(xì)胞免疫為主的Th1應(yīng)答,即重組蛋白ESAT-6及CFP-10具有Th1免疫原性。 2.重組沙門菌表達(dá)的ESAT-6、CFP-10及其特異性免疫應(yīng)答分析 為了分析重組沙門菌誘導(dǎo)ESAT-6及CFP-10蛋白特異性免疫應(yīng)答,將ESAT-6及CFP-10蛋白編碼基因分別插入原核載體pYA3333中,將構(gòu)建正確的質(zhì)粒分別命名為pYA33-esat和pYA33-cfp。通過電穿孔法轉(zhuǎn)化減毒鼠傷寒沙門菌X4550,獲得重組菌X4550(33-esat)和X4550(33-cfp)。以每只1×108 cfu劑量的重組菌滴鼻免疫C57BL/6小鼠,間隔18d,在進(jìn)行第2次免疫后10d取免疫小鼠脾臟、肺臟、腸系膜淋巴結(jié)(Mesenteric lymph node, MLN)及派伊爾氏結(jié)(Peyer’s patches, PP)細(xì)胞,以ESAT-6和CFP-10蛋白作為刺激原,檢測(cè)抗原特異性的IFN-γ分泌細(xì)胞和IL-4分泌細(xì)胞。結(jié)果表明,經(jīng)沙門菌表達(dá)運(yùn)送的結(jié)核分枝桿菌抗原ESAT-6和CFP-10均能誘導(dǎo)特異性的免疫應(yīng)答。在肺臟及PP細(xì)胞中,檢測(cè)到較高水平的IFN-γ分泌細(xì)胞,與IL-4分泌細(xì)胞比較,差異顯著。在脾臟和MLN中,免疫應(yīng)答呈現(xiàn)平衡狀態(tài),IFN-γ分泌細(xì)胞和IL-4分泌細(xì)胞數(shù)量相當(dāng)。此外,對(duì)脾臟、MLN、PP及支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid, BAF)細(xì)胞中的共刺激分子檢測(cè)結(jié)果表明,兩組重組菌均能上調(diào)共刺激分子的表達(dá)。利用ELISA分別在免疫鼠的血清和BAF /腸黏膜中檢測(cè)到ESAT-6及CFP-10蛋白特異性的IgG和IgA抗體。從而表明,以滴鼻方式接種重組減毒沙門菌,能夠誘導(dǎo)ESAT-6及CFP-10蛋白特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答,在黏膜鄰近器官組織中,免疫應(yīng)答趨于細(xì)胞免疫,而在黏膜遠(yuǎn)端免疫器官和組織中,免疫應(yīng)答則處于平衡狀態(tài)。以滴鼻免疫重組菌,不僅能誘導(dǎo)有效的體液免疫還可以激發(fā)局部的黏膜免疫,這為呼吸道疾病的防控提供了新的依據(jù)。 3.沙門菌鞭毛蛋白嵌合表達(dá)的ESAT-6及其免疫學(xué)特性分析 為研究以沙門菌鞭毛系統(tǒng)作為運(yùn)送載體誘導(dǎo)的ESAT-6特異性免疫應(yīng)答,利用overlap PCR將ESAT-6蛋白編碼基因插入沙門菌鞭毛蛋白基因fliC的高變區(qū)域,構(gòu)建成嵌合鞭毛片段fliC/esat。將fliC/esat片段插入原核表達(dá)載體pET,構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pET-fliC/esat。將質(zhì)粒pET-fliC/esat通過電穿孔法轉(zhuǎn)化沙門菌LB5000,重組菌命名為L(zhǎng)B5000(fliC/esat)。用P22噬菌體介導(dǎo)LB5000(fliC/esat)向都柏林沙門菌SL5928的轉(zhuǎn)導(dǎo),利用PCR、動(dòng)力學(xué)檢測(cè)及凝集試驗(yàn)鑒定并獲得陽性轉(zhuǎn)導(dǎo)菌SL5928(fliC/esat)。將轉(zhuǎn)導(dǎo)菌SL5928(fliC/esat)感染結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29,證實(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)菌具有良好的感染能力;黏附力試驗(yàn)證實(shí),轉(zhuǎn)導(dǎo)菌具有良好的黏附特性。利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)導(dǎo)菌SL5928(fliC/esat)感染BMDC、F4/80+ MФ和腸上皮細(xì)胞(Enterocyte, EC)后的TLR-5 mRNA表達(dá),結(jié)果在3h時(shí),三種細(xì)胞就能表達(dá)TLR-5 mRNA;至6h,TLR-5 mRNA表達(dá)量有所升高。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,將轉(zhuǎn)導(dǎo)菌以每只1×107cfu滴鼻免疫C57BL/6小鼠,并于第二次免疫后10d,檢測(cè)脾臟、肺臟、MLN、PP及鼻咽相關(guān)淋巴結(jié)(Nasopharynx associated lymph node,NALT)細(xì)胞中的IFN-γ和IL-4分泌細(xì)胞數(shù)。結(jié)果在肺臟、PP及NALT細(xì)胞中,IFN-γ分泌細(xì)胞與IL-4分泌細(xì)胞水平相比較顯著升高,免疫應(yīng)答趨向于Th1型;而在脾臟及MLN中,IFN-γ與IL-4分泌細(xì)胞數(shù)無顯著性差異,免疫應(yīng)答呈現(xiàn)Th1/Th2混合應(yīng)答,處于平衡狀態(tài)。而在體內(nèi)的CTL實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),與重組菌X4550(33-esat)相比較,轉(zhuǎn)導(dǎo)菌SL5928(fliC/esat)誘導(dǎo)的CTL具有較強(qiáng)的特異性殺傷力。在血清及BAF的抗體檢測(cè)中顯示,轉(zhuǎn)導(dǎo)菌能夠誘導(dǎo)一定水平的血清IgG和黏膜IgA抗體。綜上所述,鞭毛中嵌合MTB抗原ESAT-6后,不影響鞭毛自身特性,經(jīng)沙門菌鞭毛系統(tǒng)運(yùn)送,能夠誘導(dǎo)ESAT-6抗原特異的細(xì)胞及黏膜免疫應(yīng)答,這為TB疫苗研究開辟了新的研究方向。 4.嵌合鞭毛蛋白fliC/esat與BCG黏膜共免疫誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答分析 為研究嵌合鞭毛蛋白在TB免疫的中作用,將原核表達(dá)質(zhì)粒pET-fliC/esat及pET-fliC轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),誘導(dǎo)表達(dá)嵌合蛋白fliC/esat及鞭毛蛋白fliC。SDS-PAGE分析結(jié)果表明,嵌合蛋白及fliC蛋白均以可溶性表達(dá),大小分別約為64kD和57kD。將嵌合蛋白和fliC蛋白分別進(jìn)行Western-blotting分析,以鼠傷寒沙門菌全菌血清作為一抗,結(jié)果顯示嵌合蛋白及fliC蛋白均能與多抗血清反應(yīng)。與ESAT-6蛋白相比較,嵌合蛋白及鞭毛蛋白fliC在體外均能誘導(dǎo)BMDC成熟。體外刺激F4/80+ MФ細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,ESAT-6蛋白、fliC蛋白及嵌合蛋白均能上調(diào)腹腔MФ共刺激分子CD40、CD80、CD86和CD54。三種蛋白刺激BMDC及分選的F4/80+ MФ細(xì)胞分泌IL-12p70的檢測(cè)結(jié)果顯示,在刺激BMDC時(shí),與ESAT-6蛋白組相比較,嵌合蛋白能夠誘導(dǎo)分泌較高水平的IL-12p70;而在刺激F4/80+ MФ細(xì)胞時(shí),與對(duì)照相比較,三種蛋白刺激后,F4/80+ MФ細(xì)胞均不能分泌有效的IL-12p70。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,用嵌合蛋白靜脈注射免疫C57BL/6小鼠,結(jié)果嵌合蛋白免疫組能夠顯著增強(qiáng)ESAT-6特異性免疫應(yīng)答,而且免疫應(yīng)答以Th1為主。此外,將BCG與嵌合蛋白共滴鼻免疫發(fā)現(xiàn),在肺臟、PP、NALT及脾臟中均能誘導(dǎo)顯著的Th1應(yīng)答,與嵌合蛋白單一免疫組相比較,BCG能夠增強(qiáng)ESAT-6特異性的免疫水平。檢測(cè)CD8+CD69+細(xì)胞結(jié)果表明,BCG與嵌合蛋白共免疫組的CD8+CD69+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均高于單獨(dú)BCG及嵌合蛋白免疫組。從而說明,鞭毛嵌合表達(dá)ESAT-6抗原,有利于增強(qiáng)ESAT-6的特異性應(yīng)答,鞭毛蛋白對(duì)ESAT-6抗原具有佐劑作用。BCG與嵌合蛋白共免疫結(jié)果提示,BCG與嵌合ESAT-6抗原的鞭毛蛋白之間具有協(xié)同作用,能夠提高ESAT-6特異的免疫應(yīng)答水平。
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【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392

【引證文獻(xiàn)】

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1 李云云;郭萬柱;;減毒沙門氏菌載體在獸用疫苗研發(fā)中的應(yīng)用[J];廣東畜牧獸醫(yī)科技;2013年04期

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本文編號(hào)：2287470