發(fā)布時間：2018-10-21 15:25

【摘要】：背景 EB病毒(epstein-barr virus)又稱人類皰疹病毒(Human herpesvirus4(HHV-4))。EB病毒主要感染人類B淋巴細胞和口咽上皮細胞,EB病毒與淋巴瘤、鼻咽癌以及胃癌的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)。 鼻咽癌又稱廣東癌,具有明顯的地域性。中國的鼻咽癌患者占世界的80%,而且集中在廣東一帶,特別是在珠江三角洲、西江流域一帶。而歐美國家則較為少見；鼻咽癌可分為高分化型鼻咽癌、低分化型鼻咽癌和未分化型鼻咽癌。其中中國患者以低分化型或未分化型鼻咽癌為主,而歐美國家主要是以高分化型鼻咽癌為主。在絕大多數(shù)的低分化型和幾乎所有的未分化型的鼻咽癌的活檢組織中可發(fā)現(xiàn)EB病毒。然而在高分化型的鼻咽癌活檢組織中EB病毒卻較為少見。 EB病毒與淋巴瘤之間的關(guān)系研究已經(jīng)越來越清楚。EB病毒進入B淋巴細胞的途徑使通過CR2介導(dǎo)的。CR2分為膜內(nèi)部分、跨膜部分和膜外部分,其中膜外部分是有15-16個短共有重復(fù)序列(SCR1-16)組成。EB病毒與人CR2結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域是人CR2上的SCR1-2與EB病毒的gp350結(jié)合。然而EB病毒與鼻咽癌之間的關(guān)系依然存在著許多問題有待解決。目前對于EB病毒到底進入鼻咽上皮細胞的具體途徑還不清楚,在細胞水平上研究發(fā)現(xiàn),EB病毒可以通過游離EB病毒形式直接感染鼻咽上皮細胞,也可以是感染EB病毒的淋巴細胞與鼻咽上皮細胞通過細胞與細胞接觸形式感染鼻咽上皮細胞,而且這個途徑EB病毒感染效率遠高于直接感染途徑。從第二種EB病毒感染鼻咽上皮細胞的途徑,目前提出了一種鼻咽癌發(fā)生發(fā)展假說：EB病毒首先感染B淋巴細胞,人的鼻咽部組織中有豐富的淋巴組織,這樣使得感染EB病毒的淋巴細胞與鼻咽上皮細胞接觸,從而使鼻咽上皮細胞感染EB病毒。再經(jīng)過多次的基因突變,最終發(fā)展為鼻咽癌細胞。EB病毒對鼻咽癌發(fā)生發(fā)展起到重要作用,但仍然有許多問題有待解決,目前認為EB病毒的LMP1、LMP2A等基因?qū)Ρ茄拾┌l(fā)生發(fā)展起到重要作用,其中LMP1已被確認為是一種癌基因。 由于鼻咽癌發(fā)生的解剖部位隱匿,且鼻咽癌具有明顯的區(qū)域性,在國際上研究相對較少,這造成目前鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展有許多問題有待解決。這樣,構(gòu)建EB病毒相關(guān)的鼻咽癌動物模型對于研究EB病毒與鼻咽癌之間的關(guān)系,以及EB病毒在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展所起到的作用具有重要的意義。 目前的鼻咽癌動物模型主要是以小鼠的鼻咽癌模型為主,然而鼻咽癌的豬動物模型還未曾有相關(guān)的報道。而且豬的鼻咽癌動物模型相對小鼠鼻咽癌動物模型有幾大優(yōu)勢：1、有文獻報道豬能夠得自發(fā)性鼻咽癌。然而,未見小鼠自發(fā)性鼻咽癌的報道。2、豬與人之間在遺傳水平上的同源性相對比小鼠的同源性更高。3、豬在解剖、組織、生理和營養(yǎng)代謝等方面與人類相近。4、由于解剖結(jié)構(gòu)的原因(小鼠鼻咽部較較為狹窄,成瘤之后容易引起窒息而死)豬的鼻咽癌模型比小鼠鼻咽癌模型在成瘤后生存時間更長。 在構(gòu)建豬鼻咽癌模型前需要先了解EB病毒與豬的親和性。首先我們知道人淋巴細胞對EB病毒的親和力比人鼻咽上皮細胞對EB病毒的親和力更高,并且可以在體外用EB病毒誘導(dǎo)人外周血B淋巴細胞轉(zhuǎn)化為永生化的B淋巴母細胞,而且目前認為EB病毒感染鼻咽上皮細胞是通過感染EB病毒的淋巴細胞通過與鼻咽上皮細胞間接觸而感染；其次是豬外周血淋巴細胞相對鼻咽上皮組織取材更加容易。所以本文通過用EB病毒在體外感染豬外周血淋巴細胞,觀察是否使豬淋巴細胞感染EB病毒,是否可以使豬淋巴細胞轉(zhuǎn)化為永生化淋巴母細胞。來研究EB病毒對豬的親和性。從而對構(gòu)建EB病毒相關(guān)的豬鼻咽癌動物模型起到一定的指導(dǎo)意義。 研究方法 第一部分：EB病毒感染豬淋巴細胞 1、從B95-8細胞株(EB病毒轉(zhuǎn)化的絨猴淋巴細胞)中提取EB病毒。 2、所提取的EB病毒分別感染豬、人外周血淋巴細胞以及小鼠脾臟淋巴細胞(研究表明EB病毒能夠再體外轉(zhuǎn)化人淋巴細胞,設(shè)為陽性對照；EB病毒不能在體外轉(zhuǎn)化小鼠淋巴細胞,設(shè)為陰性對照)：首先用人淋巴細胞分離液分別從豬、人外周血淋巴細胞中分離出豬淋巴細胞和人淋巴細胞,以及用小鼠淋巴細胞分離液從小鼠脾臟研磨液中分離出小鼠淋巴細胞；然后再用EB病毒分別感染豬、人、小鼠淋巴細胞,此為實驗組。未用EB病毒感染的豬、人、小鼠淋巴細胞為對照組；將實驗組和對照組在同等條件下培養(yǎng)30天,在第1、4、7、10、13、16、19、22、25、28天的時候通過鏡下觀察各個實驗組和對照組細胞的轉(zhuǎn)化情況。提取DNA,檢測EB病毒的感染情況。 3、構(gòu)建CR2的表達載體,通過lipofectamine2000將CR2表達載體轉(zhuǎn)入到豬和小鼠的淋巴細胞上。 4、EB病毒感染人淋巴細胞和表達CR2的豬淋巴細胞和小鼠淋巴細胞,此為實驗組；EB病毒感染轉(zhuǎn)染空載體的豬淋巴細胞和小鼠淋巴細胞為對照組1；無EB病毒感染的豬、人、小鼠淋巴細胞為對照組2。；細胞培養(yǎng)與EB病毒檢測方法同第3步。 第二部分：生物信息學(xué)對人、豬、鼠的CR2的分析 1、從NCBI中搜索出人CR2、豬CR2和鼠CR2的相應(yīng)的cDNA序列和氨基酸序列。并且分別對人與豬、人與鼠的CR2的cDNA序列以及氨基酸序列進行比對兩兩比對,來分析人與豬、人與鼠的CR2在cDNA和氨基酸序列上的差異； 2、根據(jù)所檢索的人CR2、豬CR2和鼠CR2的氨基酸序列,對相應(yīng)的蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)預(yù)測。 3、EB病毒與人CR2結(jié)合關(guān)鍵區(qū)域：人CR2的SCR1-2和EB病毒的gp350。從NCBI中搜索SCR1-2和gp350的氨基酸序列；并且通過BLAST找出豬CR2和鼠CR2與人SCR1-2的同源序列。 4、根據(jù)所得到的豬CR2和鼠CR2與人SCR1-2的同源序列、人SCR1-2、gp350的氨基酸序列,進行相對應(yīng)的蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)預(yù)測,并且找出結(jié)合的關(guān)鍵位點,以及找出為什么豬CR2和鼠CR2不能介導(dǎo)EB病毒。 第三部分：EB病毒感染鼻咽癌細胞。 1、EB病毒通過兩種途徑感染鼻咽癌細胞株：選取兩種鼻咽癌細胞株CNE1和CNE2。用游離EB病毒直接感染CNE1和CNE2,此為實驗組1；用B95-8細胞株分別和CNE1、CNE2共培養(yǎng)的接觸感染途徑,此為實驗組2；并且設(shè)立對照組,即沒有EB病毒感染的CNE1和CNE2。 2、上述的CNE1/CNE2的實驗組1、實驗組2和對照組進行細胞培養(yǎng)2周之后,采用PCR和Q-PCR方法檢測CNE1/CNE2各組的細胞EBNA1基因,用來反映EB病毒感染情況； 3、檢測感染后的細胞增殖,遷移能力：2周之后,收集細胞,用平板克隆形成實驗來檢測細胞的增殖能力、用細胞生長曲線實驗來檢測細胞的增殖能力；并且用劃痕實驗來檢測細胞的遷移能力。 結(jié)果 1、EB病毒能夠感染人淋巴細胞,并使入淋巴細胞轉(zhuǎn)化,而不能感染豬、小鼠淋巴細胞 EB病毒感染人淋巴細胞第13天出現(xiàn)克隆生長,并且可以多次傳代仍然保持克隆生長,說明人淋巴細胞轉(zhuǎn)化成功。PCR檢測EBNA1為陽性；豬未出現(xiàn)克隆生長,但豬淋巴細胞聚集現(xiàn)象明顯。PCR檢測EBNA1為陰性；小鼠未出現(xiàn)克隆生長,但小鼠淋巴細胞未見聚集現(xiàn)象,貼壁現(xiàn)象明顯。PCR檢測EBNA1為陰性。 2、成功構(gòu)建人CR2(hCR2)表達載體 用PCR方法從pMD18-T-CR2載體上獲取帶BglⅡ和SalI限制性內(nèi)切酶序列的CR2片段,將回收的CR2片段連接到用上述限制性內(nèi)切酶酶切后的pEGFP-N1質(zhì)粒上,對酶切鑒定正確的質(zhì)粒進行測序,測序結(jié)果NCBI中進行blast比對結(jié)果是正確的。 3、豬和小鼠淋巴細胞在轉(zhuǎn)染hCR2之后,能夠被EB病毒感染 用hCR2轉(zhuǎn)染豬和小鼠淋巴細胞,再用EB病毒感染,western blot和Q-PCR檢測hCR2,結(jié)果為陽性,說明轉(zhuǎn)染成功；western blot和Q-PCR檢測EBNA1,結(jié)果為陽性,說明EB病毒能夠感染轉(zhuǎn)染hCR2的豬和小鼠淋巴細胞。 4、信息學(xué)分析人CR2與豬CR2和鼠CR2存在差異 通過BLAST比對發(fā)現(xiàn)人CR2與豬CR2、人CR2與鼠CR2在cDNA和氨基酸序列上存在差異；完整的人CR2、豬CR2、鼠CR2蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)存在差異；人CR2與EB病毒結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域SCR1-2的七個關(guān)鍵氨基酸當(dāng)中,小鼠CR2與人SCR1-2同源比對中關(guān)鍵結(jié)合位點Arg-89對應(yīng)氨基酸為Lys；而豬CR2與人SCR1-2同源比對中關(guān)鍵結(jié)合位點Lys-41對應(yīng)氨基酸為Arg。 5、EB病毒通過細胞共培養(yǎng)途徑感染鼻咽癌細胞效率高于EB病毒直接感染途徑。 EB病毒通過細胞共培養(yǎng)途徑和直接感染途徑分別感染CNE1和CNE22周后,用western blot和Q-PCR檢測EBNA發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)途徑感染效率高于EB病毒直接途徑。 結(jié)論 1、EB病毒在正常情況下能夠通過CR2感染人淋巴細胞,但是不能感染豬、小鼠淋巴細胞 2、豬和小鼠淋巴細胞在轉(zhuǎn)染hCR2之后,能夠被EB病毒感染。 3、人CR2與豬CR2和鼠CR2存在差異；小鼠CR2不被EB病毒感染可能是與人SCR1-2同源比對中關(guān)鍵結(jié)合位點Arg-89對應(yīng)氨基酸為Lys；而豬CR2不被EB病毒感染可能是與人SCR1-2同源比對中關(guān)鍵結(jié)合位點Lys-41對應(yīng)氨基酸為Arg。 4、EB病毒接觸感染方式使EB病毒感染CNE2/CNE2的效率高于EB病毒直接感染。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R373.11

【參考文獻】

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1 陳燕,陳小毅;EBV-LMP1對鼻咽癌細胞系CNE1細胞凋亡的影響[J];癌癥;2002年05期

2 任彩萍,藍軻,馮湘玲,許亮國,何志巍,劉衛(wèi)東,王慧,姚開泰;采用原位雜交及電鏡檢測CR2轉(zhuǎn)染小鼠細胞的EB病毒感染[J];病毒學(xué)報;2001年01期

3 藍軻,喬貴林,沈新民,張玲,呂麗春,姚開泰;鼻咽癌來源潛伏膜蛋白1的表達誘發(fā)轉(zhuǎn)基因小鼠鼻咽不典型增生[J];動物醫(yī)學(xué)進展;2002年05期

4 任彩萍,藍軻,劉衛(wèi)東,何志巍,王慧,姚開泰;小鼠補體受體Ⅱ型基因改造后感染EB病毒[J];湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2001年02期

5 王琳;CD21/CR2的研究進展[J];免疫學(xué)雜志;2003年S1期

6 夏蓓莉，左O，葉紋，李采娟，陳秀珍;環(huán)胞菌素A對建立EB病毒轉(zhuǎn)化的B淋巴母細胞系的促進作用[J];上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;1996年02期

7 劉敏,吳雄文,吳鋒,楊志章,趙修竹;簡單可行的EB病毒轉(zhuǎn)化B淋巴細胞方法的探討[J];同濟醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;1997年04期

8 劉慶;滕艷霞;牛勇;劉清君;段化偉;賓萍;鄭玉新;戴宇飛;;EB病毒轉(zhuǎn)化人外周血B淋巴細胞的影響因素研究[J];衛(wèi)生研究;2009年05期

9 陳玉漢;;豬的鼻咽癌和副鼻竇癌[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報;1980年04期

10 陳玉漢;陳灼懷;肖振德;;母豬的群發(fā)性多原發(fā)癌瘤[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報;1982年02期

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本文編號：2285520