【摘要】：背景 EB病毒(epstein-barr virus)又稱人類皰疹病毒(Human herpesvirus4(HHV-4))。EB病毒主要感染人類B淋巴細(xì)胞和口咽上皮細(xì)胞,EB病毒與淋巴瘤、鼻咽癌以及胃癌的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)。 鼻咽癌又稱廣東癌,具有明顯的地域性。中國的鼻咽癌患者占世界的80%,而且集中在廣東一帶,特別是在珠江三角洲、西江流域一帶。而歐美國家則較為少見；鼻咽癌可分為高分化型鼻咽癌、低分化型鼻咽癌和未分化型鼻咽癌。其中中國患者以低分化型或未分化型鼻咽癌為主,而歐美國家主要是以高分化型鼻咽癌為主。在絕大多數(shù)的低分化型和幾乎所有的未分化型的鼻咽癌的活檢組織中可發(fā)現(xiàn)EB病毒。然而在高分化型的鼻咽癌活檢組織中EB病毒卻較為少見。 EB病毒與淋巴瘤之間的關(guān)系研究已經(jīng)越來越清楚。EB病毒進(jìn)入B淋巴細(xì)胞的途徑使通過CR2介導(dǎo)的。CR2分為膜內(nèi)部分、跨膜部分和膜外部分,其中膜外部分是有15-16個(gè)短共有重復(fù)序列(SCR1-16)組成。EB病毒與人CR2結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域是人CR2上的SCR1-2與EB病毒的gp350結(jié)合。然而EB病毒與鼻咽癌之間的關(guān)系依然存在著許多問題有待解決。目前對(duì)于EB病毒到底進(jìn)入鼻咽上皮細(xì)胞的具體途徑還不清楚,在細(xì)胞水平上研究發(fā)現(xiàn),EB病毒可以通過游離EB病毒形式直接感染鼻咽上皮細(xì)胞,也可以是感染EB病毒的淋巴細(xì)胞與鼻咽上皮細(xì)胞通過細(xì)胞與細(xì)胞接觸形式感染鼻咽上皮細(xì)胞,而且這個(gè)途徑EB病毒感染效率遠(yuǎn)高于直接感染途徑。從第二種EB病毒感染鼻咽上皮細(xì)胞的途徑,目前提出了一種鼻咽癌發(fā)生發(fā)展假說：EB病毒首先感染B淋巴細(xì)胞,人的鼻咽部組織中有豐富的淋巴組織,這樣使得感染EB病毒的淋巴細(xì)胞與鼻咽上皮細(xì)胞接觸,從而使鼻咽上皮細(xì)胞感染EB病毒。再經(jīng)過多次的基因突變,最終發(fā)展為鼻咽癌細(xì)胞。EB病毒對(duì)鼻咽癌發(fā)生發(fā)展起到重要作用,但仍然有許多問題有待解決,目前認(rèn)為EB病毒的LMP1、LMP2A等基因?qū)Ρ茄拾┌l(fā)生發(fā)展起到重要作用,其中LMP1已被確認(rèn)為是一種癌基因。 由于鼻咽癌發(fā)生的解剖部位隱匿,且鼻咽癌具有明顯的區(qū)域性,在國際上研究相對(duì)較少,這造成目前鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展有許多問題有待解決。這樣,構(gòu)建EB病毒相關(guān)的鼻咽癌動(dòng)物模型對(duì)于研究EB病毒與鼻咽癌之間的關(guān)系,以及EB病毒在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展所起到的作用具有重要的意義。 目前的鼻咽癌動(dòng)物模型主要是以小鼠的鼻咽癌模型為主,然而鼻咽癌的豬動(dòng)物模型還未曾有相關(guān)的報(bào)道。而且豬的鼻咽癌動(dòng)物模型相對(duì)小鼠鼻咽癌動(dòng)物模型有幾大優(yōu)勢(shì)：1、有文獻(xiàn)報(bào)道豬能夠得自發(fā)性鼻咽癌。然而,未見小鼠自發(fā)性鼻咽癌的報(bào)道。2、豬與人之間在遺傳水平上的同源性相對(duì)比小鼠的同源性更高。3、豬在解剖、組織、生理和營養(yǎng)代謝等方面與人類相近。4、由于解剖結(jié)構(gòu)的原因(小鼠鼻咽部較較為狹窄,成瘤之后容易引起窒息而死)豬的鼻咽癌模型比小鼠鼻咽癌模型在成瘤后生存時(shí)間更長(zhǎng)。 在構(gòu)建豬鼻咽癌模型前需要先了解EB病毒與豬的親和性。首先我們知道人淋巴細(xì)胞對(duì)EB病毒的親和力比人鼻咽上皮細(xì)胞對(duì)EB病毒的親和力更高,并且可以在體外用EB病毒誘導(dǎo)人外周血B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為永生化的B淋巴母細(xì)胞,而且目前認(rèn)為EB病毒感染鼻咽上皮細(xì)胞是通過感染EB病毒的淋巴細(xì)胞通過與鼻咽上皮細(xì)胞間接觸而感染；其次是豬外周血淋巴細(xì)胞相對(duì)鼻咽上皮組織取材更加容易。所以本文通過用EB病毒在體外感染豬外周血淋巴細(xì)胞,觀察是否使豬淋巴細(xì)胞感染EB病毒,是否可以使豬淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為永生化淋巴母細(xì)胞。來研究EB病毒對(duì)豬的親和性。從而對(duì)構(gòu)建EB病毒相關(guān)的豬鼻咽癌動(dòng)物模型起到一定的指導(dǎo)意義。 研究方法 第一部分：EB病毒感染豬淋巴細(xì)胞 1、從B95-8細(xì)胞株(EB病毒轉(zhuǎn)化的絨猴淋巴細(xì)胞)中提取EB病毒。 2、所提取的EB病毒分別感染豬、人外周血淋巴細(xì)胞以及小鼠脾臟淋巴細(xì)胞(研究表明EB病毒能夠再體外轉(zhuǎn)化人淋巴細(xì)胞,設(shè)為陽性對(duì)照；EB病毒不能在體外轉(zhuǎn)化小鼠淋巴細(xì)胞,設(shè)為陰性對(duì)照)：首先用人淋巴細(xì)胞分離液分別從豬、人外周血淋巴細(xì)胞中分離出豬淋巴細(xì)胞和人淋巴細(xì)胞,以及用小鼠淋巴細(xì)胞分離液從小鼠脾臟研磨液中分離出小鼠淋巴細(xì)胞；然后再用EB病毒分別感染豬、人、小鼠淋巴細(xì)胞,此為實(shí)驗(yàn)組。未用EB病毒感染的豬、人、小鼠淋巴細(xì)胞為對(duì)照組；將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在同等條件下培養(yǎng)30天,在第1、4、7、10、13、16、19、22、25、28天的時(shí)候通過鏡下觀察各個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞的轉(zhuǎn)化情況。提取DNA,檢測(cè)EB病毒的感染情況。 3、構(gòu)建CR2的表達(dá)載體,通過lipofectamine2000將CR2表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到豬和小鼠的淋巴細(xì)胞上。 4、EB病毒感染人淋巴細(xì)胞和表達(dá)CR2的豬淋巴細(xì)胞和小鼠淋巴細(xì)胞,此為實(shí)驗(yàn)組；EB病毒感染轉(zhuǎn)染空載體的豬淋巴細(xì)胞和小鼠淋巴細(xì)胞為對(duì)照組1；無EB病毒感染的豬、人、小鼠淋巴細(xì)胞為對(duì)照組2。；細(xì)胞培養(yǎng)與EB病毒檢測(cè)方法同第3步。 第二部分：生物信息學(xué)對(duì)人、豬、鼠的CR2的分析 1、從NCBI中搜索出人CR2、豬CR2和鼠CR2的相應(yīng)的cDNA序列和氨基酸序列。并且分別對(duì)人與豬、人與鼠的CR2的cDNA序列以及氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)兩兩比對(duì),來分析人與豬、人與鼠的CR2在cDNA和氨基酸序列上的差異； 2、根據(jù)所檢索的人CR2、豬CR2和鼠CR2的氨基酸序列,對(duì)相應(yīng)的蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。 3、EB病毒與人CR2結(jié)合關(guān)鍵區(qū)域：人CR2的SCR1-2和EB病毒的gp350。從NCBI中搜索SCR1-2和gp350的氨基酸序列；并且通過BLAST找出豬CR2和鼠CR2與人SCR1-2的同源序列。 4、根據(jù)所得到的豬CR2和鼠CR2與人SCR1-2的同源序列、人SCR1-2、gp350的氨基酸序列,進(jìn)行相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),并且找出結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn),以及找出為什么豬CR2和鼠CR2不能介導(dǎo)EB病毒。 第三部分：EB病毒感染鼻咽癌細(xì)胞。 1、EB病毒通過兩種途徑感染鼻咽癌細(xì)胞株：選取兩種鼻咽癌細(xì)胞株CNE1和CNE2。用游離EB病毒直接感染CNE1和CNE2,此為實(shí)驗(yàn)組1；用B95-8細(xì)胞株分別和CNE1、CNE2共培養(yǎng)的接觸感染途徑,此為實(shí)驗(yàn)組2；并且設(shè)立對(duì)照組,即沒有EB病毒感染的CNE1和CNE2。 2、上述的CNE1/CNE2的實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2和對(duì)照組進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)2周之后,采用PCR和Q-PCR方法檢測(cè)CNE1/CNE2各組的細(xì)胞EBNA1基因,用來反映EB病毒感染情況； 3、檢測(cè)感染后的細(xì)胞增殖,遷移能力：2周之后,收集細(xì)胞,用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力、用細(xì)胞生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力；并且用劃痕實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。 結(jié)果 1、EB病毒能夠感染人淋巴細(xì)胞,并使入淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化,而不能感染豬、小鼠淋巴細(xì)胞 EB病毒感染人淋巴細(xì)胞第13天出現(xiàn)克隆生長(zhǎng),并且可以多次傳代仍然保持克隆生長(zhǎng),說明人淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化成功。PCR檢測(cè)EBNA1為陽性；豬未出現(xiàn)克隆生長(zhǎng),但豬淋巴細(xì)胞聚集現(xiàn)象明顯。PCR檢測(cè)EBNA1為陰性；小鼠未出現(xiàn)克隆生長(zhǎng),但小鼠淋巴細(xì)胞未見聚集現(xiàn)象,貼壁現(xiàn)象明顯。PCR檢測(cè)EBNA1為陰性。 2、成功構(gòu)建人CR2(hCR2)表達(dá)載體 用PCR方法從pMD18-T-CR2載體上獲取帶BglⅡ和SalI限制性內(nèi)切酶序列的CR2片段,將回收的CR2片段連接到用上述限制性內(nèi)切酶酶切后的pEGFP-N1質(zhì)粒上,對(duì)酶切鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果NCBI中進(jìn)行blast比對(duì)結(jié)果是正確的。 3、豬和小鼠淋巴細(xì)胞在轉(zhuǎn)染hCR2之后,能夠被EB病毒感染 用hCR2轉(zhuǎn)染豬和小鼠淋巴細(xì)胞,再用EB病毒感染,western blot和Q-PCR檢測(cè)hCR2,結(jié)果為陽性,說明轉(zhuǎn)染成功；western blot和Q-PCR檢測(cè)EBNA1,結(jié)果為陽性,說明EB病毒能夠感染轉(zhuǎn)染hCR2的豬和小鼠淋巴細(xì)胞。 4、信息學(xué)分析人CR2與豬CR2和鼠CR2存在差異 通過BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)人CR2與豬CR2、人CR2與鼠CR2在cDNA和氨基酸序列上存在差異；完整的人CR2、豬CR2、鼠CR2蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)存在差異；人CR2與EB病毒結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域SCR1-2的七個(gè)關(guān)鍵氨基酸當(dāng)中,小鼠CR2與人SCR1-2同源比對(duì)中關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)Arg-89對(duì)應(yīng)氨基酸為L(zhǎng)ys；而豬CR2與人SCR1-2同源比對(duì)中關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)Lys-41對(duì)應(yīng)氨基酸為Arg。 5、EB病毒通過細(xì)胞共培養(yǎng)途徑感染鼻咽癌細(xì)胞效率高于EB病毒直接感染途徑。 EB病毒通過細(xì)胞共培養(yǎng)途徑和直接感染途徑分別感染CNE1和CNE22周后,用western blot和Q-PCR檢測(cè)EBNA發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)途徑感染效率高于EB病毒直接途徑。 結(jié)論 1、EB病毒在正常情況下能夠通過CR2感染人淋巴細(xì)胞,但是不能感染豬、小鼠淋巴細(xì)胞 2、豬和小鼠淋巴細(xì)胞在轉(zhuǎn)染hCR2之后,能夠被EB病毒感染。 3、人CR2與豬CR2和鼠CR2存在差異；小鼠CR2不被EB病毒感染可能是與人SCR1-2同源比對(duì)中關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)Arg-89對(duì)應(yīng)氨基酸為L(zhǎng)ys；而豬CR2不被EB病毒感染可能是與人SCR1-2同源比對(duì)中關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)Lys-41對(duì)應(yīng)氨基酸為Arg。 4、EB病毒接觸感染方式使EB病毒感染CNE2/CNE2的效率高于EB病毒直接感染。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R373.11

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2285520