【摘要】： 目的:從建立表皮細(xì)胞去分化模型入手,比較去分化來源的表皮干細(xì)胞和機(jī)體自身來源的表皮干細(xì)胞在功能和生物學(xué)特性等方面的異同點,為實現(xiàn)無延遲、無瘢痕完美修復(fù)及皮膚組織的再生提供新的實驗參考。 方法:采用免疫組織化學(xué)的方法探尋胎兒皮膚中的表皮干細(xì)胞(epidermal stemcells,ESCs),研究不同發(fā)育時期ESCs在胎兒皮膚中分布與遷移。采用改良的Ⅳ型膠原鋪板選擇黏附法分離培養(yǎng)人ESCs,觀察其形態(tài)及增值分化的特點,并進(jìn)行細(xì)胞免疫組織化學(xué)鑒定。同時,提取小鼠胚胎發(fā)育中期組織液,模擬表皮干細(xì)胞壁龕微環(huán)境,采用免疫組織化學(xué)、免疫熒光染色、流式細(xì)胞檢測及RT-PCR技術(shù)研究表皮干細(xì)胞在此環(huán)境中的表型變化,探討表皮干細(xì)胞周圍生長微環(huán)境在表皮干細(xì)胞“命運”決定過程中的作用。此外,本研究在前期的工作基礎(chǔ)上,建立表皮細(xì)胞去分化研究的體內(nèi)、體外實驗?zāi)Ｐ?采用免疫組織化學(xué)、MTT法、免疫熒光染色、流式細(xì)胞技術(shù)、掃描及透射電鏡檢測技術(shù)、RT-PCR、Western-blot及TRAP法再次驗證表皮細(xì)胞通過去分化途徑形成機(jī)體內(nèi)源性去分化來源的表皮干細(xì)胞,參與皮膚組織的創(chuàng)傷修復(fù)與再生。同時,從細(xì)胞表型、超微結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能等方面比較去分化來源的表皮干細(xì)胞和機(jī)體自身來源的表皮干細(xì)胞二者之間的異同點。 結(jié)果:表皮干細(xì)胞在從基底層經(jīng)棘層和顆粒層到角質(zhì)層的分化遷移過程中,經(jīng)歷了有序的成熟模式,這一過程與角蛋白的程序性表達(dá)密切相關(guān);毛囊的發(fā)生、發(fā)育不僅與ESCs的增殖分化有關(guān),同時受到毛乳頭的誘導(dǎo)作用。改良的Ⅳ型膠原選擇黏附法能夠高效的分離表皮中的干細(xì)胞。這些細(xì)胞具有干細(xì)胞的形態(tài)特點表達(dá)α_6整合素,β_1整合素,CK19,CK14,p63,Nestin及PCNA為陽性,而CK10染色為陰性;激光共聚焦檢測顯示α_6整合素和CD71在表皮干細(xì)胞中的分布存在著區(qū)域性差異,可以作為區(qū)分標(biāo)志之一,為ESCs及其亞群的分離與鑒定提供實驗參考。此外,流式細(xì)胞檢測顯示胚胎組織提取液作用后α_6~+CD71~-表達(dá)細(xì)胞由細(xì)胞總數(shù)的22.49%減少至10.92%,而α_6~+CD71~+、α_6~-CD71~+表達(dá)細(xì)胞則分別由誘導(dǎo)前的62.29%及0.19%增加至誘導(dǎo)后的68.34%及4.51%。RT-PCR結(jié)果表明胚胎組織提取液作用后,表皮干細(xì)胞中β_1整合素、CKl9、CK10表達(dá)增強(qiáng),而CK14表達(dá)減弱。本文在前期工作的基礎(chǔ)上,建立了表皮細(xì)胞去分化研究的體內(nèi)、體外實驗?zāi)Ｐ?免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示去基底層的超薄皮片CK19和β_1整合素染色為陰性;而移植第3、5、7d后,存活皮片內(nèi)CK19和β_1整合素染色陽性的細(xì)胞重新出現(xiàn),并且呈多層分布;流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明移植前后α_6~+CD71~-和α_6~+CD71~+細(xì)胞比例有明顯差異。人細(xì)胞系HEKa體外培養(yǎng)6～7代時,開始出現(xiàn)老化跡象。細(xì)胞免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示此時細(xì)胞表達(dá)CK10為強(qiáng)陽性,而β_1整合素、CK19表達(dá)為陰性,CK14則呈現(xiàn)弱陽性染色。在濃度為100ng/ml的bFGF誘導(dǎo)培養(yǎng)36～48h后,老化的HEKa細(xì)胞之間開始出現(xiàn)新生的表皮干細(xì)胞樣克隆。這些細(xì)胞體積較小,為圓梭形,形態(tài)均一、折光性強(qiáng)、胞質(zhì)近中央處有圓形核,核漿比大,因此稱之為去分化來源的表皮干細(xì)胞(dHEK細(xì)胞)。dHEK細(xì)胞不但具有克隆形成能力,而且具有強(qiáng)大的分裂增殖能力。隨著培養(yǎng)的延長,dHEK細(xì)胞克隆的面積逐漸增大,相互連接成片,并且和周圍的HEKa細(xì)胞之間相互嵌合形成表皮嵴樣結(jié)構(gòu)。免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)bFGF誘導(dǎo)培養(yǎng)后,實驗組細(xì)胞中β_1整合素、CK19和CK14的表達(dá)增強(qiáng);CK10作為終末分化細(xì)胞的標(biāo)志,在bFGF誘導(dǎo)組中的表達(dá)明顯降低。流式細(xì)胞檢測分析顯示bFGF作用后,實驗組CK14表達(dá)陽性的細(xì)胞與對照組相比明顯增多(分別為87.14%和67.26%)。CK19表達(dá)陽性的細(xì)胞也由原來的15.74%增加至被檢測細(xì)胞總數(shù)的74.77%。而bFGF誘導(dǎo)作用后,被檢測細(xì)胞中表達(dá)CK10陽性的細(xì)胞數(shù)量較對照組明顯下降(分別為4.56%和98.56%)。此外,RT-PCR和Western-blot檢測結(jié)果同樣再次支持了表皮細(xì)胞去分化的現(xiàn)象。在bFGF作用后,表皮細(xì)胞重新程序化,并獲得其前體干細(xì)胞的某些潛在能力,表達(dá)表皮干細(xì)胞的一些未分化蛋白。另外,表皮干細(xì)胞和去分化來源的dHEK細(xì)胞之間有兩個顯著的相同點:(1)二者都表達(dá)表皮干細(xì)胞的表面標(biāo)志,如β_1整合素、α_6整合素和CK19等;(2)二者都存在著α_6整合素和CD71表達(dá)的區(qū)域性分布差異。此外,表皮干細(xì)胞和dHEK細(xì)胞之間的差異點有:(1)CD71-PE和α6 integrin-FITC直標(biāo)雙色熒光流式檢測分析顯示表皮干細(xì)胞和去分化來源的dHEK細(xì)胞之間存在著細(xì)胞亞群的分布差異;(2)hTERT在表皮干細(xì)胞和去分化而來的干細(xì)胞中存在著亞細(xì)胞定位差異。 結(jié)論:ESCs并非真正靜止的未分化細(xì)胞,而是一種已經(jīng)進(jìn)入分化狀態(tài)但是仍具有多向分化潛能的干細(xì)胞,其增殖分化行為不但受到自身程序化基因表達(dá)的影響,同時又受到其所處的微環(huán)境的調(diào)控。bFGF能夠誘導(dǎo)表皮細(xì)胞在體外發(fā)生去分化,去分化而來的表皮干細(xì)胞與ESCs相比具有更加強(qiáng)大的分裂增殖能力,可以作為種子細(xì)胞應(yīng)用于皮膚創(chuàng)傷修復(fù)與再生的相關(guān)研究之中。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R329

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本文編號：2283945