【摘要】： 【目的】 研究仿生電刺激對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的誘導(dǎo)作用及強(qiáng)度。 【方法】 1.按不同接種密度、血清濃度、首次換液時(shí)間及PH值分組接種MSCs,10天后進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù),探討其適宜的培養(yǎng)條件,采用MTT法繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線,免疫組織化學(xué)化檢測(cè)MSCs CD44、CD34表達(dá)情況,流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSCs生長(zhǎng)周期。 2.采用兩種不同次序的胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化方法(方法1 0.125%胰酶+0.1%Ⅱ型膠原酶混合液逐次消化心肌組織;方法2 0.1%Ⅱ型膠原酶單獨(dú)消化心肌組織數(shù)次基礎(chǔ)上再單用0.125%胰酶逐次消化心肌組織),分離新生大鼠的心肌細(xì)胞,比較兩種消化方法獲得心肌細(xì)胞數(shù)量及存活率的差別,同時(shí)進(jìn)行心肌細(xì)胞體外培養(yǎng),觀察其形態(tài)學(xué)變化,并以細(xì)胞免疫熒光進(jìn)行心肌細(xì)胞純度鑒定。 3.將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(經(jīng)DAPI標(biāo)記)與心肌細(xì)胞按固定比例共同培養(yǎng)(MSCs /心肌細(xì)胞共培養(yǎng)體系),按是否給予仿生電刺激分為非電刺激組和電刺激組,刺激組每日給予仿生電刺激2h,頻率0.5Hz、脈寬5ms、電壓10V(電流強(qiáng)度20μA),每組又以實(shí)驗(yàn)干預(yù)培養(yǎng)時(shí)間(3、5、7天)分為三個(gè)亞組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組)。分別于實(shí)驗(yàn)的第3、5、7天觀察各組細(xì)胞生長(zhǎng)情況,細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞cTnT的表達(dá)情況。 4.取傳代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MSCs,吸棄DMEM低糖培養(yǎng)液,換上含胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液;給予仿生電刺激的為實(shí)驗(yàn)干預(yù)組(每天給予電刺激2h,刺激7天),沒(méi)有給予仿生電刺激的為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組;仿生電刺激的頻率為0.5Hz,脈寬5ms,按照刺激電壓強(qiáng)度5V、10V、20V(分別對(duì)應(yīng)的電流強(qiáng)度為10μA、20μA、40μA)分為三個(gè)亞組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組);電刺激干預(yù)7天后,分別取實(shí)驗(yàn)干預(yù)各亞組細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞行cTnT抗體免疫熒光染色,觀察各組細(xì)胞有無(wú)出現(xiàn)心肌細(xì)胞特異性肌鈣蛋白的表達(dá)。 【結(jié)果】 1.MSCs貼壁呈纖維樣生長(zhǎng),細(xì)胞較佳接種密度為5×105/cm2,合適血清濃度為10%,較合適首次換液時(shí)間為48h,培養(yǎng)液較佳的PH值為7.2左右;MSCs經(jīng)歷生長(zhǎng)停滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、平臺(tái)期;MSCs膜上存在CD44陽(yáng)性表達(dá),無(wú)CD34表達(dá);流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSCs大部分處于靜止G0/G1期。 2.兩種不同次序消化方法心肌細(xì)胞分離良好,收獲細(xì)胞數(shù)量及存活率高,方法2細(xì)胞存活率高于方法1;分離的細(xì)胞體外培養(yǎng)可貼壁搏動(dòng)生長(zhǎng),免疫熒光顯示培養(yǎng)的心肌細(xì)胞純度達(dá)95%以上。 3.離體心肌微環(huán)境誘導(dǎo)MSCs中,仿生電刺激組細(xì)胞較非電刺激組生長(zhǎng)良好,實(shí)驗(yàn)第5天非電刺激組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞沒(méi)有cTnT表達(dá),電刺激組有少數(shù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞出現(xiàn)cTnT表達(dá)。實(shí)驗(yàn)第7天非電刺激組和電刺激組MSCs均有cTnT表達(dá),電刺激組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞cTnT陽(yáng)性細(xì)胞率高于非電刺激組。 4.仿生電直接刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞7天后,倒置顯微鏡下觀察,各實(shí)驗(yàn)干預(yù)組及實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的MSCs細(xì)胞均明顯鋪開(kāi)生長(zhǎng),形態(tài)、大小不一;分別取實(shí)驗(yàn)干預(yù)的各亞組細(xì)胞(按刺激電壓強(qiáng)度5v、10v、20v分為三個(gè)亞組)和對(duì)照組細(xì)胞行cTnT抗體免疫熒光染色,均未見(jiàn)有心肌特異性肌鈣蛋白的表達(dá)。 【結(jié)論】 1.仿生電刺激可促進(jìn)離體心肌細(xì)胞誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化:使其更早出現(xiàn)心肌樣細(xì)胞改變;提高大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的比率。 2.在我們實(shí)驗(yàn)研究的參數(shù)范圍內(nèi),單獨(dú)的生物電刺激尚不足以誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞的分化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2283015