【摘要】： 近30年來新發(fā)現(xiàn)的病原體已多達數(shù)十種,其中有很多是由病原性細菌引發(fā)的感染性疾病。微生物的自然進化、重組是導(dǎo)致新病原體出現(xiàn)的內(nèi)在因素;同時隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展與普及,人工構(gòu)建新型重組病原菌也已成為可能。因此,面對未來可能出現(xiàn)的新病原菌以及新型重組的生物恐怖病原菌,必須建立起快速檢測鑒定的有效方法。 與病原體致病性緊密相關(guān)的基本元件是病原體的致病相關(guān)基因、毒力基因、抗性基因以及病原體的種類(菌種特異性基因)等,利用對上述基本元件的檢測,可以達到對新型病原體或重組病原體進行檢測鑒定。但是目前對于毒力因子的研究鑒定還很不完整,尤其是單個致病菌菌株中已鑒定的毒力因子還無法解釋其全部的致病過程,例如:目前已知的研究比較全面的致病性大腸桿菌O157:H7的毒力因子等。也就是說現(xiàn)有的毒力因子數(shù)量還不足以完成致病菌的毒力與毒力重組分析,因此我們首先對現(xiàn)有毒力因子進行系統(tǒng)分析研究,希望從中發(fā)現(xiàn)某些規(guī)律。 近年來研究發(fā)現(xiàn):部分已鑒定的致病菌毒力因子同樣出現(xiàn)在非致病菌基因組中。為了對這一問題有一個清楚的了解,我們對一些公共的毒力因子數(shù)據(jù)庫進行比較分析后,選取VFDB(Virulence factor database)毒力因子數(shù)據(jù)庫并從該數(shù)據(jù)庫中下載了來自于已完成全基因組測序的51株致病性細菌菌株中的1988個毒力基因,采用直系同源基因預(yù)測的方法,根據(jù)每一個毒力基因在非致病菌中有無直系同源基因,將毒力基因分為致病菌特有毒力基因和共有毒力基因,總共獲得了620個致病菌特有毒力基因和1368個共有毒力基因,分別占據(jù)毒力基因總數(shù)的31.19%和68.81%。 眾所周知,致病菌中的毒力島和致病菌的致病密切相關(guān)。因此我們首先系統(tǒng)研究了毒力基因和致病菌中毒力島的關(guān)系,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)致病菌特有毒力基因傾向于分布在毒力島上,而共有毒力因子更傾向于分布在毒力島之外。這就提示我們:致病菌特有毒力基因和致病菌的致病有著更加緊密的聯(lián)系。然后我們按毒力因子數(shù)據(jù)庫VFDB上對毒力基因的分類,將1988個毒力基因歸類到49個毒力因子功能類中,對每一個毒力因子功能類在致病菌特有毒力基因和共有毒力基因上的分布進行了統(tǒng)計分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn):外毒素、三型分泌系統(tǒng)中效應(yīng)蛋白和未分類蛋白、四型分泌系統(tǒng)和毒力島等毒力因子功能類更傾向于分布在致病菌特有毒力基因上;而鞭毛、莢膜、內(nèi)毒素、離子代謝、六型分泌系統(tǒng)、調(diào)控基因和二型分泌系統(tǒng)等毒力因子功能類更傾向于分布在致病菌共有毒力基因上。同時在各功能類的統(tǒng)計結(jié)果中,我們發(fā)現(xiàn)有一部分外毒素基因同樣出現(xiàn)在共有毒力基因中,因此我們進一步對所有外毒素基因進行了統(tǒng)計分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分的外毒素基因都是致病菌所特有的,而對于那些未包含在致病菌特有基因中的外毒素基因,經(jīng)過相關(guān)文獻調(diào)研,我們發(fā)現(xiàn)這部分外毒素基因或者不是真正的外毒素(主要功能與外毒素分泌相關(guān)),或者它們是否是外毒素目前仍存在爭議。同時經(jīng)過相關(guān)文獻調(diào)研,我們還發(fā)現(xiàn)大部分四型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白基因也是致病菌所特有的。最終經(jīng)過對傾向于分布在致病菌特有毒力基因和共有毒力基因中的各功能類在致病過程中的功能角色的分析比較,我們得出:致病菌特有毒力基因可能更直接參與致病菌毒力的形成,而共有毒力基因主要與致病菌致病的結(jié)構(gòu)及基礎(chǔ)功能更相關(guān)(基本生物學(xué)過程),更傾向于參與與宿主的一般相互作用。 通過對現(xiàn)有毒力因子的系統(tǒng)分析研究,我們發(fā)現(xiàn):對于新病原體或重組病原體的檢測鑒定,利用致病菌特有毒力基因分析能更準(zhǔn)確的反映致病菌的毒力與毒力重組。但是目前已鑒定的致病菌特有毒力基因數(shù)據(jù)量太少,而整個細菌基因組相對龐大,直接分析困難;并且基因組中與毒力不相干的成分太多,干擾結(jié)果判讀。因此,我們擬將致病菌特有毒力基因放大,提出了致病菌特有基因:即只在致病菌中出現(xiàn)而在非致病菌中不包含的基因。首先,從NCBI GenBank上下載已完成全基因組測序的細菌菌株的全基因組蛋白質(zhì)序列,構(gòu)建了致病菌蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫和非致病菌蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,利用設(shè)計的基于樣本庫減模式的相似性比對方法對致病菌特有蛋白進行了預(yù)測。預(yù)測結(jié)果中致病菌特有蛋白總數(shù)約占致病菌基因組總蛋白的10.15%,這樣就大大減少了整個基因組的數(shù)據(jù)量,并且將致病菌致病相關(guān)基因得到富集。 在得到致病菌特有基因的基礎(chǔ)上,通過對未知病原體全基因組進行分析,可以利用基于基因檢測技術(shù)來確定一個病原菌中可能存在的所有毒力基因、抗性基因以及菌種特異性基因,是否存在外源毒力基因或抗性基因,這些基因組成與現(xiàn)有已知致病菌有何異同,我們就可以推測出此病原體是否為已知病原體、重組病原體或新病原體,它是由什么原始病菌或非致病菌改構(gòu)而來的,它含有什么新的毒力基因、抗性基因等,它可能的致病機制是什么。但是,基于基因檢測的技術(shù)對于那些經(jīng)過體外進化或片段重組的新型改構(gòu)毒力基因可能無效。我們知道:功能的最小單位不是基因而是功能基團,那么無論是使用體外進化還是片段重組等技術(shù)所發(fā)展的新型毒力或抗性基因,都離不開基本功能基團的復(fù)用,因此從理論上來說,對于未知病原體的檢測鑒定采用基于功能基團的檢測技術(shù)將具有更大的優(yōu)勢。 為此,我們對獲得的致病菌特有蛋白進行了特有功能基團的識別研究,主要通過利用InterProscan分析工具對致病菌特有蛋白序列和非致病菌蛋白序列進行功能基團識別,最終比較獲得了370個致病菌特有功能基團。經(jīng)過對僅在細菌上有分布的242個致病菌特有功能基團在致病菌上的統(tǒng)計分析,我們發(fā)現(xiàn)致病菌特有功能基團可以代表許多致病菌的毒力或致病性,并且致病菌特有功能基團具有屬、種、株特異性以及特定感染途徑特異性。因此基于功能基團的檢測,可以發(fā)現(xiàn)新病原體具有某菌屬或菌種的相同或相似特征,進而提示新病原體的可能致病機制以及可能的重組來源。但是在致病菌特有功能基團的識別結(jié)果中,大部分致病菌特有蛋白未包含已知的功能基團,這主要是由于目前已確定的功能集團數(shù)量依然太少,那么下一步的問題就是如何確定和發(fā)現(xiàn)新的功能基團。 功能基團的本質(zhì)是在進化過程中蛋白質(zhì)具有的局部高度保守的序列片段。在微生物進化過程中,由于多功能基因融合事件的出現(xiàn),將會導(dǎo)致致病菌特有蛋白質(zhì)序列中出現(xiàn)非致病菌蛋白質(zhì)功能基團,也就是說致病菌特有基因序列中會出現(xiàn)部分非致病菌基因序列,這樣就會影響我們對致病菌檢測結(jié)果的判讀。因此,可以通過尋找致病菌特有基因的保守序列片段來代替尋找新的功能基團;這樣無論未知病原體來源如何,都能檢測出一定的保守序列,根據(jù)這些序列在已知病原菌中的分布情況,就能對未知病原體進行檢測和鑒定。 對于致病菌特有保守序列片段的識別,我們主要通過將獲得的致病菌特有基因序列打散,去除生物學(xué)意義上的干擾序列片段以及在非致病菌基因組中出現(xiàn)的片段,最終得到了長度為29 mer的致病菌特有基因片段115,152條。初步分析這些片段的分布,發(fā)現(xiàn)致病菌特有基因片段在各致病菌菌種和菌株上分布具有均衡性;接著我們完成了致病菌特有基因片段在不同致病菌及其基因中的分布,包括致病菌中各菌屬、菌種、菌株以及各基因上的特異性特有片段分布,構(gòu)建了致病菌特有指紋數(shù)據(jù)庫。為了驗證致病菌特有指紋庫中致病菌特有基因片段的特異性,我們對新完成全基因組測序的3株致病菌菌株進行了模擬雜交(這3株菌不包含在我們的研究數(shù)據(jù)中)。雜交結(jié)果表明:利用致病菌特有基因片段能很好的區(qū)分致病菌的種屬與重組。此外,基于獲得的致病菌特有保守片段,我們設(shè)計了等溫探針設(shè)計算法,按照特有片段的分布共設(shè)計等溫探針29,169條,構(gòu)建了致病菌特異性探針數(shù)據(jù)庫。這樣基于構(gòu)建的致病菌特有指紋庫和致病菌特異性探針數(shù)據(jù)庫,就可以結(jié)合小片段測序技術(shù)或芯片技術(shù)來確定未知病原體的種屬特征,毒力組成及毒力重組信息。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R373

【共引文獻】

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2 陳建,羅向東,楊宗城;內(nèi)毒素激活效應(yīng)細胞的分子機制[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;1999年11期

3 萬志紅,陳惠孫,陸松敏,劉建倉;內(nèi)毒素血癥小鼠巨噬細胞膜脂改變對CD14表達及TNFα分泌的影響[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2001年07期

4 Edward N. Trifonov;;Thirty Years of Multiple Sequence Codes[J];Genomics, Proteomics & Bioinformatics;2011年Z1期

5 郭麗娟;致齲菌對膠原的粘附[J];國外醫(yī)學(xué).口腔醫(yī)學(xué)分冊;1997年05期

6 郭洪志,屈傳強,賈建平;急性前腦缺血致多器官功能障礙綜合征動物模型的建立及內(nèi)毒素受體CD14的表達[J];中國腦血管病雜志;2004年02期

7 萬志紅,王宇明,劉國棟;模擬肽對LPS誘導(dǎo)CD14的表達[J];上海免疫學(xué)雜志;2003年05期

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9 廖雪玲,馬娟,樓濱,吳滿平;血漿高密度脂蛋白的組成成分在LPS誘導(dǎo)的急性相反應(yīng)中的改變[J];復(fù)旦學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2004年05期

10 羨曉輝;黃新莉;周曉紅;張景琨;凌亦凌;;硫化氫與內(nèi)毒素血癥大鼠心肌損傷的關(guān)系[J];生理學(xué)報;2007年03期

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本文編號：2271393