【摘要】： 研究背景：BMSCs是成體非神經(jīng)組織源性神經(jīng)干細(xì)胞研究最多的一種。目前對(duì)于BMSCs定向分化為神經(jīng)元的分子調(diào)控機(jī)制仍不清楚,因?yàn)閙iR-124和miR-128在神經(jīng)系統(tǒng)含量豐富且特異性較高,本實(shí)驗(yàn)通過體外誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元分化,觀察miR-124和miR-128的表達(dá)情況,以了解它們對(duì)BMSCs定向分化為神經(jīng)元過程中發(fā)揮的作用。 目的：本部分的研究旨在通過檢測(cè)BMSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元的過程中miR-124和miR-128的表達(dá)情況,從而初步探討miR-124和miR-128在BMSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元的過程中所發(fā)揮的作用。 方法：采用全骨髓培養(yǎng)法體外分離培養(yǎng)獲得BMSCs,根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的貼壁能力進(jìn)行純化,倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)變化,取傳代培養(yǎng)至第三代的BMSCs,其中一部分細(xì)胞進(jìn)行CD71免疫熒光技術(shù)檢測(cè),另一部分細(xì)胞加入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)分化。然后應(yīng)用ABI公司的TaqMan MicroRNA Assays real-time PCR技術(shù),采用兩步法,先將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,再檢測(cè)miR-124和miR-128在BMSCs誘導(dǎo)分化過程中的表達(dá)變化。 結(jié)果：miR-124在BMSCs分化所得神經(jīng)元中的表達(dá)是未分化時(shí)的0.051倍(P0.05)；miR-128在BMSCs分化所得神經(jīng)元中的表達(dá)是未分化時(shí)的0.070倍(P0.05)。 結(jié)論：miR-124和miR-128在BMSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元的過程中可起重著要的調(diào)控作用。 研究背景：神經(jīng)干細(xì)胞是一群具有自我更新、自我增殖和多向分化潛能的細(xì)胞。NSCs可定向誘導(dǎo)分化為膽堿能神經(jīng)元；Hox是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(motor neurons, MNs)在體內(nèi)發(fā)育的關(guān)鍵因子之一,而miR-126可以通過綁定到同源框來調(diào)控Hoxa9,因此,我們通過實(shí)驗(yàn)來探討是否miR-126在脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的發(fā)育過程也起相關(guān)作用。miR-31是一種胚胎干細(xì)胞特異性的niRNA。我們通過培養(yǎng)、分離和誘導(dǎo)脊髓源神經(jīng)干細(xì)胞(spinal cord stem cells, SCSCs)以及采用免疫磁珠分選法分離純化胚胎脊髓源運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,然后檢測(cè)miR-126和miR-31在MNs及SCSCs分化過程中的表達(dá)情況,從而初步探討它們?cè)谏窠?jīng)干細(xì)胞中定向分化過程中的作用。 目的：通過觀察miR-126和miR-31在MNs及神經(jīng)干細(xì)胞分化過程中的表達(dá)情況,初步探討它們?cè)谏窠?jīng)干細(xì)胞定向分化過程中的作用。 方法：采用孕齡17d的胚胎大鼠脊髓組織,分離、培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞,傳代擴(kuò)增。對(duì)第3代的神經(jīng)干細(xì)胞球進(jìn)行神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白(neuroepithelial stem proteins, Nestin)免疫熒光檢測(cè)。然后,應(yīng)用誘導(dǎo)因子RA、音猬因子(sonic hedgehog, Shh)、NT-3和BDNF對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化。分化兩周后,用免疫熒光檢測(cè)膽堿能神經(jīng)元特異性標(biāo)志物膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(choline acetyltransferase, ChAT)的表達(dá)。在另外一個(gè)實(shí)驗(yàn)中,我們用免疫磁珠法分離純化胚胎脊髓源運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。最后應(yīng)用ABI公司的TaqMan MicroRNA Assays real-time PCR技術(shù),來觀察miR-126和miR-31在MNs及神經(jīng)干細(xì)胞分化過程中的表達(dá)情況。 結(jié)果：miR-126在SCSCs中的表達(dá)是其分化所得膽堿能神經(jīng)元中的0.142倍。miR-31在SCSCs中的表達(dá)是其分化所得膽堿能神經(jīng)元的0.118倍。miR-126在膽堿能神經(jīng)元中的表達(dá)是在MNs中的0.002倍。miR-31在膽堿能神經(jīng)元中的表達(dá)是在MNs中的56.444倍。Hoxa9在膽堿能神經(jīng)元中的表達(dá)是在MNs中的0.169倍。Shh在MNs中有表達(dá),而在膽堿能神經(jīng)元中用實(shí)時(shí)定量PCR無(wú)法檢測(cè)到。 結(jié)論：miR-31在膽堿能神經(jīng)元中較運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元高表達(dá)說明了我們誘導(dǎo)所得細(xì)胞(膽堿能神經(jīng)元)與目的細(xì)胞(運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元)之間可能存在差異；miR-126和miR-31在神經(jīng)干細(xì)胞的分化過程中起著重要的調(diào)控重要作用；
[Abstract]:BACKGROUND: BMSCs are one of the most widely studied adult non-neural tissue-derived neural stem cells. At present, the molecular mechanism of directional differentiation of BMSCs into neurons is still unclear, because of the rich and high specificity of microRNAs-124 and microRNAs-128 in the nervous system. This experiment induced BMSCs to differentiate into neurons in vitro, and observed microRNAs-124 and microRNAs-128. The expression of iR-128 in order to understand their role in BMSCs directed differentiation into neurons.
AIM: To investigate the role of microRNAs-124 and microRNAs-128 in BMSCs-induced neuronal differentiation by detecting the expression of microRNAs-124 and microRNAs-128 during BMSCs-induced neuronal differentiation.
METHODS: BMSCs were isolated and cultured in vitro by whole bone marrow culture method. BMSCs were purified according to the adherence ability of the cultured cells. The morphological changes were observed under inverted microscope. BMSCs were subcultured to the third generation. Some of the cells were detected by CD71 immunofluorescence technique, and the others were induced by adding induced differentiation medium. Differentiation. Then, using the TaqMan MicroRNA Assay real-time PCR technique of ABI Company, the total RNA was first retrieved into a cDNA by two-step method, and then the expression changes of microRNA-124 and microRNA-128 in BMSCs induced differentiation were detected.
Results: The expression of Mi-124 in differentiated BMSCs neurons was 0.051 times higher than that in undifferentiated BMSCs neurons (P 0.05), and the expression of Mi-128 in differentiated BMSCs neurons was 0.070 times higher than that in undifferentiated BMSCs neurons (P 0.05).
Conclusion: Mi-124 and Mi-128 play important roles in the differentiation of BMSCs into neurons.
BACKGROUND: Neural stem cells are a group of cells with the potential of self-renewal, self-proliferation and multi-differentiation. NSCs can induce the differentiation of cholinergic neurons directionally; Hox is one of the key factors for the development of motor neurons (MNs) in vivo, and Mi-126 can regulate Hoxa9 by binding to homologous frameworks. Therefore, we pass on Mi-31 is an embryonic stem cell-specific niRNA. We isolate and induce spinal cord stem cells (SCSCs) by culture and isolate and purify embryonic spinal cord-derived motor nerves by immunomagnetic beads sorting. We then examined the expression of microRNAs-126 and microRNAs-31 in the differentiation of NN and SCSCs to explore their roles in the differentiation of neural stem cells.
Objective: To investigate the expression of microRNAs-126 and microRNAs-31 in the differentiation of neural stem cells (NSCs) and neural stem cells (NSCs).
METHODS: Neural stem cells (NSCs) were isolated from spinal cord of 17-day-old embryonic rats and cultured for passage and amplification. Neuroepithelial stem cell proteins (Nestin) of the third generation NSCs were detected by immunofluorescence assay. Then, RA, Shh, NT-3 and BDNF were applied to the neurons. Stem cells were induced to differentiate. Two weeks after differentiation, the expression of choline acetyltransferase (ChAT), a specific marker of cholinergic neurons, was detected by immunofluorescence assay. In another experiment, we isolated and purified embryonic spinal cord-derived motor neurons by immunomagnetic beads. Finally, ABI's TaqMan MicroRNA As was used. To observe the expression of microRNAs-126 and microRNAs-31 in NN and neural stem cell differentiation by real-time PCR.
Results: The expression of Mi-126 in SCSC was 0.142 times as high as that in differentiated cholinergic neurons. The expression of Mi-31 in SCSC was 0.118 times as high as that in differentiated cholinergic neurons. The expression of Mi-126 in cholinergic neurons was 0.002 times as high as that in MNS. The expression of Mi-31 in cholinergic neurons was 56.444 times as high as that in MNS. The expression of cholinergic neurons was 0.169 times that of MNs. Shh was expressed in MNs, but could not be detected in cholinergic neurons by real-time quantitative PCR.
CONCLUSION: The high expression of microRNAs-31 in cholinergic neurons suggests that there may be differences between the cholinergic neurons and the target cells, and microRNAs-126 and microRNAs-31 play an important role in the differentiation of neural stem cells.
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R329

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