發(fā)布時(shí)間：2018-09-17 12:44

【摘要】： 目的： 利用反向遺傳學(xué)操作構(gòu)建登革病毒復(fù)制子的反式包裝系統(tǒng)；在此基礎(chǔ)上,制備登革病毒單輪感染性顆粒,為登革熱新型疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.在登革1型病毒廣州分離株基因組全長(zhǎng)感染性克隆的基礎(chǔ)上,利用重疊PCR擴(kuò)增獲得病毒基因組5’端與GFP融合片段,將其插入病毒基因組中以替換病毒的絕大部分結(jié)構(gòu)基因,并獲得帶有綠色熒光蛋白的病毒復(fù)制子DV1-EGFP-RP。同步構(gòu)建其致死性突變復(fù)制子DV1-EGFP△GDD-RP作為對(duì)照。通過(guò)報(bào)告基因和RT-PCR的方法鑒定病毒復(fù)制子的復(fù)制特性。 2.利用重疊PCR擴(kuò)增獲得DV/JEV嵌合型prME片段,將其插入pcDNA3.1質(zhì)粒構(gòu)建相應(yīng)真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞后,通過(guò)RT-PCR和免疫熒光鑒定登革病毒prME的胞內(nèi)表達(dá)特性。利用超速離心對(duì)上清中的病毒樣顆粒進(jìn)行純化,通過(guò)電鏡和western blot對(duì)其進(jìn)行鑒定。 3.為制備獲得復(fù)制子包裝顆粒,首先將病毒復(fù)制子RNA電轉(zhuǎn)BHK-21細(xì)胞后,再利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將輔助包裝質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞,以使病毒結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白共表達(dá)于宿主細(xì)胞中。利用超速離心獲得細(xì)胞培養(yǎng)上清中的病毒樣顆粒,利用RT-PCR、western blot方法對(duì)其復(fù)制子包裝顆粒的生化組分進(jìn)行鑒定。最后將該病毒樣顆粒接種BHK-21細(xì)胞,明確其單輪感染性特征。 結(jié)果： 1.獲得了高效表達(dá)的含綠色熒光蛋白報(bào)告基因的登革病毒復(fù)制子載體。 2.成功構(gòu)建了登革病毒prME嵌合質(zhì)粒pcDV/JEV prME,并制備了分泌性病毒樣顆粒。 3.制備了具有單輪感染性的登革病毒病毒樣顆粒。 結(jié)論： 成功建立了基于登革病毒復(fù)制子的反式包裝系統(tǒng),制備了具有單輪感染性的病毒樣顆粒,為下一步的研究工作打下良好的基礎(chǔ)。
[Abstract]:Aim: to construct a trans-packaging system for dengue virus replicators by reverse genetic operation, and to prepare dengue virus single round infectious particles, which will lay a foundation for the study of new dengue vaccine. Methods: 1. Based on the full-length infectious cloning of the genome of Guangzhou isolate of dengue 1 virus, the fusion fragment of 5 'terminal and GFP of the virus genome was obtained by overlapping PCR amplification. The fusion fragment was inserted into the genome of the virus to replace most of the structural genes of the virus. The viral replicon DV1-EGFP-RP. with green fluorescent protein was obtained. The lethal mutant replicon DV1-EGFP GDD-RP was constructed simultaneously as control. Identification of replication characteristics of virus replicators by reporter gene and RT-PCR. 2. The chimeric prME fragment of DV/JEV was amplified by overlapping PCR amplification and inserted into pcDNA3.1 plasmid to construct the eukaryotic expression vector. After transfection into BHK21 cells, the intracellular expression characteristics of dengue virus prME were identified by RT-PCR and immunofluorescence. Virus-like particles in supernatant were purified by ultracentrifugation and identified by electron microscope and western blot. In order to prepare the replicon packaging particles, firstly, the viral replicon RNA was electrotransferred into BHK-21 cells, then the auxiliary packaging plasmid was introduced into the cells by liposome transfection, so that the virus structure and non-structural proteins could be co-expressed in the host cells. The viral particles in the supernatant of cell culture were obtained by ultracentrifugation and the biochemical components of the replicon packaging granules were identified by RT-PCR,western blot method. Finally, the virus-like particles were inoculated into BHK-21 cells to identify their single-round infectious characteristics. Results: 1. A highly expressed dengue virus replicon vector containing green fluorescent protein reporter gene was obtained. 2. 2. The dengue virus prME chimeric plasmid pcDV/JEV prME, was successfully constructed and secreted virus-like particles were prepared. Dengue virus-like particles with single-round infection were prepared. Conclusion: the trans-packaging system based on dengue virus replicon was successfully established, and virus like particles with single round infection were prepared, which laid a good foundation for further research.
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R373

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本文編號(hào)：2245964