【摘要】： 目的:本研究初步探討幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, H. pylori)空泡毒素單一毒力決定簇對GES-1胃黏膜上皮細胞凋亡的影響,為進一步研究H. pylori的致病機制奠定基礎(chǔ)。 方法:將本課題組已構(gòu)建的pDsRed-Monomer-C1/VacA N端真核表達載體轉(zhuǎn)染至GES-1細胞中,Western-blot鑒定VacA蛋白在細胞中的表達;電子顯微鏡和中性紅攝取試驗檢測GES-1細胞的空泡樣變;Hoechst33342染色、Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒以及電鏡觀察細胞凋亡情況,同時采用分光光度法檢測細胞Caspase-9、Caspase-3的活化程度,羅丹明123檢測細胞跨膜電位的變化, ELISA法檢測細胞色素C的釋放。 結(jié)果:重組質(zhì)粒pDsRed-Monomer-C1/VacA轉(zhuǎn)染GES-1細胞后,顯示有特異性表達條帶,24h后電鏡下可明顯觀察到空泡樣變及核固縮、染色質(zhì)邊聚等凋亡特征;重組質(zhì)粒組中性紅攝取量明顯升高,與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P 0.05)。Hoechst33342染色后鏡下可見明顯的核染色質(zhì)濃縮,轉(zhuǎn)染24h后Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒組細胞凋亡率明顯高于對照組(P 0.05)。Caspase-9和Caspase-3活化程度呈時間依賴性增加,分別在12h和24h達到峰值。Rho123染色發(fā)現(xiàn)線粒體跨膜電位明顯降低,同陰性對照組相比有統(tǒng)計學意義(P 0.05)。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組釋放細胞色素C的濃度呈時間依賴性正相關(guān),與空質(zhì)粒組及對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P 0.05)。 結(jié)論: 1. VacA蛋白瞬時高表達可誘導GES-1細胞凋亡及空泡樣變。 2. VacA蛋白可激活Caspase-9和Caspase-3,且可能主要通過線粒體途徑誘導GES-1細胞凋亡。
[Abstract]:AIM: To investigate the effect of single virulence determinant of vacuole toxin of Helicobacter pylori (H. pylori) on apoptosis of gastric epithelial cells of GES-1, and to lay a foundation for further study of the pathogenesis of H. pylori.
METHODS: The pDsRed-Monomer-C1/VacA N-terminal eukaryotic expression vector constructed by our team was transfected into GES-1 cells, and the expression of VacA protein was identified by Western-blot; the vacuole-like changes of GES-1 cells were detected by electron microscopy and neutral red uptake test; Hoechst 33342 staining, Annexin V-FITC apoptosis detection kit and electron microscopy were used. Cell apoptosis was detected by spectrophotometry. The activation of Caspase-9 and Caspase-3 was detected by spectrophotometry. The changes of transmembrane potential were detected by Rhodamine 123. The release of cytochrome C was detected by ELISA.
Results: After transfection of recombinant plasmid pDsRed-Monomer-C1/VacA into GES-1 cells, specific expression bands were found. After 24 hours, the apoptotic characteristics such as vacuole-like degeneration, nuclear condensation and chromatin margin aggregation were observed under electron microscopy. The uptake of neutral red in recombinant plasmid group was significantly increased, and the difference was statistically significant compared with the control group (P 0.05). The apoptosis rate of the recombinant plasmid group was significantly higher than that of the control group (P 0.05). The activation of Caspase-9 and Caspase-3 increased in a time-dependent manner and reached the peak at 12 h and 24 h respectively. Rho123 staining showed that the mitochondrial transmembrane potential decreased significantly. The concentration of cytochrome C released by recombinant plasmid transfection group was positively correlated in a time-dependent manner, and there was significant difference between the empty plasmid group and the control group (P 0.05).
Conclusion:
1. transient high expression of VacA protein can induce apoptosis and vacuolar transformation of GES-1 cells.
2. VacA protein can activate Caspase-9 and Caspase-3, and may induce apoptosis of GES-1 cells mainly through mitochondrial pathway.
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R378

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