【摘要】： 早期的解剖學(xué)研究發(fā)現(xiàn)骨髓內(nèi)存在交感神經(jīng)支配,并且通過(guò)對(duì)骨髓中交感神經(jīng)功能研究證實(shí)交感神經(jīng)還可以調(diào)節(jié)骨髓的功能,例如通過(guò)電刺激交感神經(jīng),導(dǎo)致骨髓內(nèi)血管收縮,紅細(xì)胞、白細(xì)胞和幼紅細(xì)胞進(jìn)入血循環(huán)增加。進(jìn)一步研究顯示交感神經(jīng)對(duì)骨髓細(xì)胞功能的調(diào)控是通過(guò)骨髓細(xì)胞上腎上腺素能受體(adrenergic receptor,AR)介導(dǎo)的。通過(guò)功能檢測(cè)與放射性配體結(jié)合研究已證實(shí)骨髓細(xì)胞表達(dá)有功能的α,β-AR。在體和體外給予腎上腺素能受體激動(dòng)劑能夠促進(jìn)骨髓細(xì)胞增殖和粒細(xì)胞生成,并成劑量效應(yīng)關(guān)系;給予β-AR激動(dòng)劑異丙腎上腺素(isoproterenol,Iso)可以通過(guò)激活骨細(xì)胞中β-AR促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖與分化。此外,有文獻(xiàn)報(bào)道交感神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)和多巴胺(dopamine,DA)能夠提高人骨髓中CD34+細(xì)胞的遷移效率提示交感神經(jīng)還參與了對(duì)干細(xì)胞動(dòng)員的調(diào)節(jié)。Katayama等報(bào)道了交感神經(jīng)系統(tǒng)還能夠調(diào)節(jié)骨髓造血干(祖)細(xì)胞(hematopoietic stem and progenitor cell,HSPC)從骨髓中的動(dòng)員和歸巢,研究發(fā)現(xiàn)在β2腎上腺素能受體激動(dòng)劑作用下促進(jìn)了粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)誘導(dǎo)的造血干細(xì)胞動(dòng)員,證實(shí)交感神經(jīng)通過(guò)AR介導(dǎo)了對(duì)干細(xì)胞動(dòng)員的調(diào)節(jié)。這些研究打破了過(guò)去傳統(tǒng)認(rèn)為的神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)和造血系統(tǒng)各系統(tǒng)之間是相互孤立,獨(dú)立起作用的觀(guān)點(diǎn);揭示出干細(xì)胞維持和活化過(guò)程的復(fù)雜性,這幾大系統(tǒng)必須相互協(xié)同,共同作用來(lái)維持正常的造血功能。 Katayama在研究中指出,NE一方面通過(guò)CXCR4/CXCL12趨化因子受體軸直接作用于HSPC,參與對(duì)HSPC動(dòng)員和歸巢的調(diào)控。另一方面,在NE刺激下G-CSF誘導(dǎo)的HSPC動(dòng)員還需要有其它細(xì)胞信號(hào)協(xié)同作用調(diào)控HSPC動(dòng)員和歸巢,這些細(xì)胞信號(hào)可能與HSPC所在的干細(xì)胞壁龕,及G-CSF影響的干細(xì)胞壁龕內(nèi)可溶性因子有關(guān),但其具體機(jī)制仍不清楚,從而提出了一個(gè)更復(fù)雜的干細(xì)胞壁龕概念。干細(xì)胞壁龕,即存在于器官或組織中的可以維持干細(xì)胞的自我更新及避免分化的微環(huán)境,包括壁龕細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)和來(lái)源于壁龕細(xì)胞的可溶性因子。干細(xì)胞壁龕為干細(xì)胞提供一個(gè)保護(hù)性微環(huán)境,來(lái)源于壁龕細(xì)胞的可溶性因子可以通過(guò)與干細(xì)胞發(fā)生直接或間接的作用,從而調(diào)控干細(xì)胞;壁龕信號(hào)的變化可引起干細(xì)胞命運(yùn)的改變,其中分泌的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子與干細(xì)胞的增殖分化密切相關(guān)。有研究報(bào)道骨髓基質(zhì)微環(huán)境能夠?qū)︷じ皆谄渲械淖婕?xì)胞發(fā)揮選擇性的抑制調(diào)節(jié)作用,抑制祖細(xì)胞的分化從而促進(jìn)其增殖潛能。基于上述這些研究有研究者提出“腦-骨髓-血液軸”觀(guān)點(diǎn),認(rèn)為在“腦-骨髓-血液軸”中,一部分信號(hào)直接傳遞給了HSPC池,另一部分信號(hào)則通過(guò)對(duì)支持營(yíng)養(yǎng)干細(xì)胞池的基質(zhì)細(xì)胞間接作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。因此,我們猜測(cè)交感神經(jīng)遞質(zhì)NE作用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),通過(guò)BMSCs細(xì)胞將信號(hào)傳遞給HSPC從而間接影響到HSPC動(dòng)員和歸巢。 BMSCs是位于干細(xì)胞壁龕中的造血微環(huán)境的主要組成成分之一,既能夠分泌種類(lèi)眾多的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子,對(duì)HSPC的增殖、凋亡和歸巢起重要調(diào)控作用。同時(shí)還高表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,如纖維黏接素、膠原、蛋白聚糖,還能表達(dá)基質(zhì)-細(xì)胞、細(xì)胞-細(xì)胞等相互作用的反受體,對(duì)骨、骨髓中細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)建起著重要作用。 有研究證實(shí)受照射小鼠給予腎上腺素能受體激動(dòng)劑可促進(jìn)骨髓細(xì)胞的增殖,提示兒茶酚胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)能夠通過(guò)刺激骨髓細(xì)胞增殖為放射損傷后的骨髓細(xì)胞提供保護(hù)作用。因此,研究交感神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)BMSCs的調(diào)控作用意義重大。一方面,闡明了交感神經(jīng)對(duì)HSPC動(dòng)員和歸巢的間接調(diào)控機(jī)制,另一方面為在嚴(yán)重創(chuàng)傷和放射復(fù)合傷造成的骨髓損傷情況下,通過(guò)神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)BMSCs的調(diào)控機(jī)制來(lái)改善骨髓造血微環(huán)境,重建造血功能,提供新的思路和救治方法。 因此,本課題首先分離培養(yǎng)大鼠骨髓BMSCs,并從細(xì)胞形態(tài)、標(biāo)志性CD分子及分化潛能三個(gè)方面對(duì)分離細(xì)胞進(jìn)行鑒定,以證實(shí)分離培養(yǎng)方法穩(wěn)定可靠。交感神經(jīng)遞質(zhì)通過(guò)腎上腺素能受體發(fā)揮其重要的生物學(xué)功能。BMSCs是否表達(dá)AR是交感神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮調(diào)控作用的重要前提。其次檢測(cè)了分離培養(yǎng)BMSCs細(xì)胞腎上腺素能受體表達(dá)情況,結(jié)果顯示BMSCs細(xì)胞僅有α1-ARs mRNA表達(dá),而不表達(dá)α2-ARs及β1,β2,β3-AR mRNA。α1-ARs在BMSCs細(xì)胞表達(dá)是否具有功能?交感神經(jīng)遞質(zhì)能否通過(guò)α1-ARs對(duì)BMSCs發(fā)揮調(diào)控作用?因此,在第二部分研究中我們將不同的化學(xué)激動(dòng)劑,拮抗劑藥物加入正常的BMSCs細(xì)胞中,阻斷其正常的信號(hào)通路觀(guān)察細(xì)胞增殖及相關(guān)基因的表達(dá)情況,以證實(shí)NE對(duì)BMSCs調(diào)控作用并探討其具體調(diào)控機(jī)制。結(jié)果顯示在α-AR激動(dòng)劑NE作用下促進(jìn)了BMSCs細(xì)胞增殖;在β-AR激動(dòng)劑Iso作用下,BMSCs細(xì)胞增殖明顯變化。NE對(duì)BMSCs細(xì)胞發(fā)揮促增殖作用的機(jī)制是通過(guò)首先激活α1-ARs,然后經(jīng)過(guò)Ca2+、PKC和ERK1/2信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 NE能夠促進(jìn)BMSCs細(xì)胞增殖,對(duì)BMSCs細(xì)胞分化是否有調(diào)控作用呢?BMSCs作為造血微環(huán)境的主要組成成分之一,能夠分泌種類(lèi)眾多的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子,以及黏附分子和細(xì)胞外基質(zhì),NE又能否影響B(tài)MSCs分泌細(xì)胞因子呢?故設(shè)計(jì)第三部分實(shí)驗(yàn),在此部分研究中對(duì)NE作用下BMSCs誘導(dǎo)形成成骨、成脂細(xì)胞的細(xì)胞分化率進(jìn)行檢測(cè),并采用定量RT-PCR和ELISA方法檢測(cè)NE對(duì)BMSCs分泌的細(xì)胞因子表達(dá)的影響。結(jié)果顯示NE對(duì)BMSCs向成骨和脂肪細(xì)胞分化無(wú)明顯影響,但對(duì)BMSCs分泌細(xì)胞因子有促進(jìn)作用。 通過(guò)以上三部分的實(shí)驗(yàn)研究與分析,獲得以下主要結(jié)果: 1、在本實(shí)驗(yàn)中選取密度梯度離心法和自然貼壁法相結(jié)合的方法分離BMSCs,并從細(xì)胞形態(tài)、標(biāo)志性CD分子及分化潛能三個(gè)方面對(duì)分離細(xì)胞進(jìn)行鑒定。鑒定結(jié)果顯示:分離細(xì)胞呈旋渦狀生長(zhǎng),形態(tài)為成纖維細(xì)胞樣的貼壁細(xì)胞;并陽(yáng)性表達(dá)BMSCs的標(biāo)志分子:CD44、CD73、CD90和CD29,不表達(dá)造血干細(xì)胞的標(biāo)志分子:CD31和CD45;具有向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化的能力。證實(shí)在本實(shí)驗(yàn)隨室條件下所分離培養(yǎng)的BMSCs是骨髓中區(qū)別造血干細(xì)胞的一群處于未分化狀態(tài)的干細(xì)胞。 2、用RT-PCR方法檢測(cè)第3代BMSCs細(xì)胞腎上腺素能受體表達(dá)情況。BMSCs細(xì)胞表達(dá)α1A-,α1B-,α1D-AR mRNA,不表達(dá)α2-ARs mRNA及β1,β2,β3-AR mRNA。 3、用3H-TdR摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度NE(10-7-10-4M)作用8h及10-5M NE作用不同時(shí)間對(duì)BMSCs細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示10-7、10-6、10-5、10-4M NE作用8h后均促進(jìn)了BMSCs細(xì)胞的增殖,比對(duì)照組分別增加5.12%、10.06%、37.3%、25.28%,在10-5M NE作用下BMSCs細(xì)胞增殖最為顯著。在α-AR拮抗劑-酚妥拉明(phentolamine,PH)作用下,BMSCs細(xì)胞增殖比在NE作用下減少了70.7%。說(shuō)明NE能夠促進(jìn)BMSCs細(xì)胞增殖,PH則通過(guò)抑制α-AR阻斷NE誘導(dǎo)的BMSCs細(xì)胞增殖。 4、在不同濃度Iso(10-7-10-4M)作用下,BMSCs細(xì)胞增殖進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示10-7、10-6、10-4M Iso作用8h后BMSCs細(xì)胞增殖與對(duì)照組比較分別減少了1.68%、1.3%、2.6%;10-5M Iso作用8h后BMSCs細(xì)胞增殖比對(duì)照組增加了0.6%,各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此結(jié)果說(shuō)明不同濃度Iso對(duì)BMSCs細(xì)胞增殖均無(wú)促進(jìn)作用。 5、用定量RT-PCR檢測(cè)BMSCs細(xì)胞α1-AR亞型mRNA表達(dá)情況。結(jié)果顯示正常組BMSCs細(xì)胞的α1A-AR,α1B-AR,α1D-AR mRNA表達(dá)維持在較低水平。在10-5M NE作用下,α1A-AR,α1B-AR,α1D-AR mRNA表達(dá)分別增加了76.54%,59.8%,113.32%,與正常對(duì)照組均差異顯著(P 0.05)。此結(jié)果說(shuō)明NE對(duì)BMSCs細(xì)胞促增殖作用是通過(guò)激活α1-AR來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 6、激光共聚焦檢測(cè)在10-5M NE作用下α1-AR下游Ca2+,PKC信號(hào)通路激活情況。結(jié)果顯示在10-5M NE作用下,BMSCs細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+流濃度顯著升高,10-6M PH組沒(méi)有觀(guān)察到Ca2+流濃度的顯著變化。結(jié)果提示NE能夠激活Ca2+流的快速流動(dòng),使胞質(zhì)內(nèi)Ca2+流濃度顯著升高,PH則可以阻斷NE對(duì)Ca2+的激活作用。對(duì)照組BMSCs中PKC蛋白在胞質(zhì)中表達(dá),加入NE10min后觀(guān)察到PKC蛋白從胞質(zhì)表達(dá)轉(zhuǎn)移到胞膜表達(dá),PH預(yù)處理組PKC蛋白僅在胞質(zhì)表達(dá),在胞膜中沒(méi)有觀(guān)察到其表達(dá)。免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果與免疫組化觀(guān)察到的結(jié)果相一致。此結(jié)果說(shuō)明NE可以直接激活PKC使其發(fā)生膜轉(zhuǎn)位,PH則可以抑制NE誘導(dǎo)的PKC激活,不使其發(fā)生膜轉(zhuǎn)位。十字孢堿(PKC抑制劑,10-7M)對(duì)NE刺激的BMSCs增殖檢測(cè)結(jié)果顯示十字孢堿預(yù)處理組較NE組BMSCs增殖減弱了59.7%,與NE組差異顯著(P 0.05)。結(jié)果提示十字孢堿可以直接抑制PKC激活從而抑制NE對(duì)BMSCs促增殖作用。說(shuō)明NE是通過(guò)激活PKC對(duì)BMSCs產(chǎn)生促增殖作用。 7、10-5M NE刺激BMSCs后ERK1/2磷酸化增加2倍(P 0.05),PH使其增加減少62.97%(P 0.05)。此結(jié)果說(shuō)明NE可以直接刺激ERK1/2磷酸化,PH則抑制了NE引起的ERK1/2磷酸化。PD98059(ERK1/2抑制劑,10-5M)對(duì)NE刺激BMSCs細(xì)胞增殖的影響結(jié)果顯示NE刺激BMSCs細(xì)胞增殖較正常組增加80%(P 0.05),PD98059使BMSCs細(xì)胞增殖減少83.2%(P 0.05)。結(jié)果說(shuō)明PD98059可以通過(guò)抑制ERK1/2激活來(lái)抑制NE誘導(dǎo)的BMSCs細(xì)胞增殖,提示NE對(duì)BMSCs細(xì)胞的增殖作用經(jīng)過(guò)ERK1/2信號(hào)途徑。在十字孢堿作用下BMSCs細(xì)胞ERK1/2磷酸化水平減少116.67%,與NE組和對(duì)照組均有顯著性差異(P 0.05)。此結(jié)果說(shuō)明十字孢堿可以通過(guò)抑制PKC激活來(lái)抑制NE誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化,提示先激活PKC,然后引起ERK1/2磷酸化,PKC是ERK1/2的上游信號(hào)通路。 8、通過(guò)對(duì)BMSCs誘導(dǎo)形成成骨、成脂細(xì)胞的細(xì)胞分化率檢測(cè),證實(shí)NE對(duì)BMSCs分化的調(diào)控。結(jié)果顯示,在10-5M NE作用下,BMSCs細(xì)胞均可誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞與脂肪細(xì)胞;對(duì)照組與10-5M NE組兩組細(xì)胞在形態(tài)上未見(jiàn)顯著差別。對(duì)照組成骨細(xì)胞分化率為14.32%,NE組分化率16.78%,兩組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)照組成脂細(xì)胞分化率為26.62%,NE組分化率25.15%,兩組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 9、對(duì)BMSCs細(xì)胞分泌表達(dá)細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果顯示,10-5M NE作用于BMSCs細(xì)胞后,IL-6、SCF、LIF和VEGF mRNA水平明顯高于對(duì)照組,分別是對(duì)照組的5.79,3.08,1.75和5.99倍,與對(duì)照組之間均有顯著性差異(P0.05)。CXCL12 mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異。在10-5M NE作用下BMSCs細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-6、SCF和VEGF蛋白含量分別是對(duì)照組的1.24,1.3和2.04倍,與對(duì)照組比較均有顯著性差異(P0.05)。提示NE對(duì)BMSCs分泌細(xì)胞因子在蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平均有調(diào)控作用,可以促進(jìn)BMSCs細(xì)胞因子的分泌。但是對(duì)BMSCs分泌趨化因子CXCL12的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有調(diào)控作用。 研究結(jié)論如下: 1、本實(shí)驗(yàn)室條件下,可以穩(wěn)定的分離培養(yǎng)出大鼠BMSCs,并通過(guò)對(duì)分離細(xì)胞的形態(tài)學(xué),細(xì)胞表型和誘導(dǎo)分化能力鑒定,證明是具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞。 2、分離BMSCs細(xì)胞不僅表達(dá)α1-ARs mRNA,而且在NE誘導(dǎo)的BMSCs細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用。 3、分離BMSCs細(xì)胞不表達(dá)β-ARs mRNA,并且β-AR激動(dòng)劑Iso對(duì)BMSCs細(xì)胞增殖無(wú)影響,提示Iso對(duì)BMSCs細(xì)胞增殖無(wú)調(diào)控作用與其不表達(dá)β-ARs有關(guān)。 4、NE可以促進(jìn)BMSCs細(xì)胞增殖。NE對(duì)BMSCs細(xì)胞促增殖作用是通過(guò)首先激活α1-ARs,然后經(jīng)過(guò)Ca2+、PKC和ERK1/2信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。NE對(duì)BMSCs誘導(dǎo)形成成骨,脂肪細(xì)胞的細(xì)胞分化率沒(méi)有影響,說(shuō)明NE對(duì)BMSCs向成骨和脂肪細(xì)胞分化不產(chǎn)生調(diào)控作用。 5、NE能夠調(diào)控BMSCs細(xì)胞因子分泌,可以促進(jìn)BMSCs表達(dá)并分泌IL-6、VEGF、LIF及SCF細(xì)胞因子;但是對(duì)趨化因子CXCL12表達(dá)無(wú)調(diào)控作用。 本研究證實(shí)交感神經(jīng)遞質(zhì)NE能夠促進(jìn)BMSCs細(xì)胞增殖,并闡明NE促進(jìn)BMSCs細(xì)胞增殖效應(yīng)的調(diào)控機(jī)制是通過(guò)首先激活α1-ARs,然后經(jīng)過(guò)Ca2+、PKC和ERK1/2信號(hào)傳導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)的。觀(guān)察了在NE作用下BMSCs分泌細(xì)胞因子IL-6、VEGF、LIF、SCF及趨化因子CXCL12表達(dá)的變化特點(diǎn)。這些結(jié)果闡明了交感神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)HSPC動(dòng)員和歸巢的間接調(diào)控機(jī)制,豐富了交感神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)骨髓細(xì)胞功能調(diào)控的理論認(rèn)識(shí),為在嚴(yán)重創(chuàng)傷和放射復(fù)合傷造成的骨髓損傷情況下,通過(guò)神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)BMSCs的調(diào)控機(jī)制來(lái)改善骨髓造血微環(huán)境,重建造血功能,提供新的思路和救治方法。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：R33

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2241030