【摘要】： 目的:從臍血中提取間充質(zhì)干細胞,進行體外擴增,摸索臍血間充質(zhì)干細胞在體外的適宜培養(yǎng)環(huán)境。探討間充質(zhì)干細胞在體外分化為肝細胞的可能性和適宜條件。 方法: 1.待胎兒娩出斷臍后,無菌條件下采血,并用肝素抗凝。使用相對密度為1.077的ficoll淋巴細胞分離液,利用密度梯度離心原理分離臍血單個核細胞。 2.貼壁培養(yǎng)法,比較不同接種密度、不同血清濃度條件下,間充質(zhì)干細胞的貼壁情況。從而摸索臍血來源間充質(zhì)干細胞的適宜培養(yǎng)環(huán)境。 3.收集4代的細胞,用流式細胞技術(shù)檢測細胞表面CD29、CD44、CD34、CD45的表達情況,來鑒定細胞表面的標志物。 4.常規(guī)方法凍存和復蘇間充質(zhì)干細胞,觀察復蘇后細胞的生長情況。 5.收集4-8代的細胞,分成5個誘導組。分別采用與正常肝細胞株LO2分層共同培養(yǎng)法、細胞因子聯(lián)合誘導法及細胞因子階段誘導法,觀察細胞形態(tài)的變化。 6.采用RT-PCR,檢測白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)及角質(zhì)蛋白(CK19)mRNA的表達情況,來鑒定間充質(zhì)干細胞的誘導分化情況。 結(jié)果: 1.10~8/ml的接種密度,7d后首次換液,可獲得較大密度的間充質(zhì)干細胞,實現(xiàn)體外生長增殖。 2.5%的血清,細胞不易貼壁、增殖緩慢。10%-15%的血清,有利于干細胞的生長增殖,且不易發(fā)生形態(tài)變化。20%的血清,細胞生長快,但易發(fā)生形態(tài)改變。 3.流式細胞技術(shù)分析:CD29(+)、CD44(+)、CD34(-)、CD45(-),與間充質(zhì)干細胞表面標志物的的特點一致。RT-PCR分析:間充質(zhì)干細胞不表達ALB、AFP及CK19。 4.本實驗所獲得的間充質(zhì)干細胞體外傳8代后,細胞增殖能力明顯減弱,體積變大,呈不規(guī)則形。第10代時,無法繼續(xù)傳代,細胞死亡。復蘇后,間充質(zhì)干細胞要經(jīng)歷1w的平臺期后,才能逐漸恢復凍存前的狀態(tài)。 5.第1誘導組(與L02共同培養(yǎng))、第2誘導組(A組誘導液)、第3誘導組(與LO2共同培養(yǎng)+A組誘導液)誘導6w,較對照組未見形態(tài)學變化,也未檢測到ALB、AFP及CK19mRNA的表達。 6.第4誘導組(B組誘導液)誘導6w,細胞形態(tài)也未有改變,未檢測到ALB、AFP及CK19mRNA的表達。 7.第5誘導組(C組誘導液)誘導4w,細胞由長梭型變?yōu)槎嘟切?RT-PCR檢測到AFPmRNA的陽性表達,繼續(xù)誘導2w后,檢測到AFPmRNA、ALBmRNA、CK19mRNA的陽性表達。但細胞死亡較多,增殖能力差,細胞密度減少明顯。 結(jié)論: 1.臍血中含有間充質(zhì)干細胞,但含量少,不同個體之間也存在生物學差異。臍血MSCs貼壁較骨髓MSCs晚,體外培養(yǎng)困難。要想實現(xiàn)體外擴增,需要高密度接種、較高的血清濃度,以10-15%為宜。但血清濃度也不能過高,過高的血清濃度(＞20%)促進細胞分化,增殖能力明顯降低。 2.體外培養(yǎng)的MSCs,傳代能力有限,P4-P8代細胞活力好。P10代細胞死亡,目前尚無法實現(xiàn)MSCs的體外無限增殖。凍存后的MSCs,復蘇后,生長緩慢,需要1w的平臺期,才能恢復凍存前的狀態(tài)。 3.體外誘導臍血MSCs向肝細胞分化,非常困難。本實驗,5個誘導組,只有第5組階段誘導法,得到了多角形的肝細胞樣細胞,RT-PCR在此種細胞內(nèi)檢測到AFPmRNA、ALBmRNA、CK19mRNA的陽性表達。證明,此種誘導方案是一種可行的誘導方法。 4.誘導過程中,細胞貼壁能力差,活力弱,擴增困難。如何實現(xiàn)誘導后細胞的體外擴增,從而能夠應(yīng)用臨床是我們下一步要解決的問題。
[Abstract]:AIM: To extract mesenchymal stem cells from umbilical cord blood and to explore the suitable culture environment for umbilical cord blood mesenchymal stem cells in vitro.
Method:
1. After the umbilical cord was cut off, the blood was collected under aseptic condition and anticoagulated with heparin. The umbilical cord blood mononuclear cells were separated by density gradient centrifugation using Ficoll lymphocyte isolation solution with relative density of 1.077.
2. Comparing the adherence of mesenchymal stem cells with different density and serum concentration, so as to explore the suitable culture environment of umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells.
3. The expression of CD29, CD44, CD34 and CD45 on the cell surface was detected by flow cytometry to identify the markers on the cell surface.
4. cryopreservation and resuscitation of mesenchymal stem cells were used to observe the growth of cells after resuscitation.
5. Cells of 4-8 generations were collected and divided into 5 induction groups. Morphological changes were observed by co-culture with LO2, cytokine induction and cytokine stage induction.
6. The expression of albumin (ALB), alpha-fetoprotein (AFP) and keratin (CK19) mRNA was detected by RT-PCR to identify the differentiation of mesenchymal stem cells.
Result:
At the density of 1.10~8/ml, the mesenchymal stem cells with higher density could be obtained after the first liquid exchange 7 days, and the proliferation of mesenchymal stem cells could be realized in vitro.
In 2.5% serum, the cells are not easy to adhere to the wall and proliferate slowly. 10% - 15% serum is conducive to the growth and proliferation of stem cells, and is not easy to change the morphology. In 20% serum, cell growth is fast, but easy to change the morphology.
3. Flow cytometry analysis: CD29 (+), CD44 (+), CD34 (-), CD45 (-), consistent with the characteristics of mesenchymal stem cell surface markers. RT-PCR analysis: mesenchymal stem cells do not express ALB, AFP and CK19.
4. After 8 passages of mesenchymal stem cells in vitro, the proliferation ability of mesenchymal stem cells was significantly weakened, and the cells became larger and irregular. At the 10th passage, the cells could not continue to pass on and died. After resuscitation, the mesenchymal stem cells would undergo a plateau period of 1 week before they could gradually recover to their pre-freezing state.
5. The 1st induction group (co-cultured with L02), the 2nd induction group (group A), the 3rd induction group (co-cultured with LO2 + group A) were induced for 6w. There were no morphological changes and no expression of ALB, AFP and CK19 mRNA in the control group.
6. The expression of ALB, AFP and CK19 mRNA was not detected in the 4th induction group (group B).
7. In group 5 (group C), AFP mRNA was detected by RT-PCR after 4 weeks of induction. AFP mRNA, ALB mRNA and CK19 mRNA were detected after 2 weeks of induction.
Conclusion:
Umbilical cord blood MSCs adhere to the wall later than bone marrow MSCs, so it is difficult to culture in vitro. In order to achieve in vitro amplification, high density inoculation is needed. A high serum concentration of 10-15% is appropriate. But serum concentration should not be too high, too high serum concentration (>20%) can promote fine. Cell differentiation and proliferation ability were significantly reduced.
2. MSCs cultured in vitro have limited ability of passage and good viability of P4-P8 generation. P10 generation cells die, so it is impossible to proliferate MSCs indefinitely in vitro. After cryopreservation, MSCs grow slowly after resuscitation. It needs a plateau period of one week to restore the state before cryopreservation.
3. It is very difficult to induce umbilical cord blood MSCs to differentiate into hepatocytes in vitro. In this experiment, polygonal hepatocyte-like cells were obtained in 5 induction groups only by stage 5 induction method. AFP mRNA, ALB mRNA and CK19 mRNA were detected by RT-PCR in these cells.
4. In the process of induction, the cell adherence ability is poor, the cell viability is weak, and the proliferation is difficult. How to achieve in vitro expansion of the induced cells, so as to be able to apply in clinical is the next step to solve the problem.
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R329

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本文編號：2238784