【摘要】： 目的研究體外大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)對(duì)肝星狀細(xì)胞(HSCs)RhoA信號(hào)因子及其細(xì)胞周期調(diào)控因子p27表達(dá)的影響,探討MSCs調(diào)控HSCs細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換機(jī)制。 方法貼壁篩選法培養(yǎng)、純化SD大鼠MSCs,傳代至第4代使用;大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)系及纖維原細(xì)胞系凍融后傳代使用。應(yīng)用6孔塑料細(xì)胞培養(yǎng)盒,每孔使用半透膜(transwell insert)建立上下雙層細(xì)胞共培養(yǎng)體系,常規(guī)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分3組:空白對(duì)照組;陰性對(duì)照組;MSCs實(shí)驗(yàn)組.用WST-8法對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖率進(jìn)行測(cè)定;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期;RT-PCR、Western blot檢測(cè)MSCs與HSCs共培養(yǎng)后HSCs內(nèi)RhoA,p27 mRNA和蛋白的表達(dá)。 結(jié)果(1) HSCs與MSCs共培養(yǎng)24h后,HSCs表現(xiàn)明顯增殖抑制(P0.01),且呈現(xiàn)時(shí)間依賴性.MSCs試驗(yàn)組與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較均有顯著性差異(P0.01;P0.01)。(2)共培養(yǎng)12h后,MSCs可阻滯HSCs由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換,使G0/G1期細(xì)胞增多,S期細(xì)胞減少,與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。(3)共培養(yǎng)12h后,MSCs實(shí)驗(yàn)組RhoA mRNA表達(dá)與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05;P0.01),隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈遞減趨勢(shì);共培養(yǎng)后,MSCs實(shí)驗(yàn)組p27 mRNA表達(dá)與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(4)共培養(yǎng)12h后,MSCs實(shí)驗(yàn)組RhoA蛋白表達(dá)與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01,P0.01),隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈遞減趨勢(shì);共培養(yǎng)12h后, MSCs實(shí)驗(yàn)組p27蛋白與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01;P0.01),隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈遞增趨勢(shì)。(5)相關(guān)性分析顯示: RhoA與p27 mRNA的表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)( r=-0.105);RhoA與p27蛋白的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)( r=-0.943, P0.01)。 結(jié)論骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抑制肝星狀細(xì)胞增殖的機(jī)制可能是通過(guò)RhoA-p27通路調(diào)控HSCs細(xì)胞周期改變;RhoA活性的下調(diào)可能是引起HSCs內(nèi)p27蛋白表達(dá)增加的原因。
[Abstract]:Objective to investigate the effect of rat bone marrow mesenchymal stem cell (MSCs) on the expression of (HSCs) RhoA signal factor and cell cycle regulator p27 in hepatic stellate cells in vitro and to explore the mechanism of MSCs regulating the G 1 / S transition of HSCs cell cycle. Methods SD rat MSCs, was cultured by adherent screening and purified to the 4th passage, and rat hepatic stellate cell (HSC-T6) and fibroblast cell lines were used after freeze-thawing. A 6 well plastic cell culture box was used to establish the upper and lower double layer cell coculture system by using semi-permeable membrane (transwell insert) in each hole, and conventional culture was carried out. The experiment was divided into 3 groups: blank control group, negative control group and MSCs experimental group. The proliferation rate of hepatic stellate cells was determined by WST-8 assay, and the expression of RhoA,p27 mRNA and protein in HSCs after co-culture of MSCs and HSCs was detected by flow cytometry. Results (1) HSCs and MSCs co-cultured for 24 hours showed obvious inhibition of proliferation (P0.01), and showed time-dependent. MSCs in the experimental group and the blank control group, there were significant differences (P0.01-P0.01). (2) after co-cultured for 12 h, the HSCs could block the transition from G0/G1 phase to S phase. Compared with the control group and the negative control group, there were significant differences in the expression of RhoA mRNA between the experimental group and the blank control group after 12 hours of co-culture (P0.01). (3). The expression of p27 mRNA in the control group was significantly higher than that in the control group (P0.05, P0.01), and the expression of p27 mRNA in the co-cultured group was significantly higher than that in the control group. There was no significant difference between the negative control group and the negative control group. (4) after co-culture for 12 hours, the expression of RhoA protein in the experimental group was significantly different from that in the blank control group (P 0.01). After co-culture for 12 hours, the p27 protein in MSCs group was compared with that in control group. There were significant differences between the negative control groups (P0.01, P0.01), and increased with time. (5) correlation analysis showed that there was no significant correlation between the expression of RhoA and p27 mRNA (r-0.105) and the expression of p27 protein was negatively correlated (r-0.943, P0.01). Conclusion the mechanism of bone marrow mesenchymal stem cells inhibiting the proliferation of hepatic stellate cells may be due to the down-regulation of HSCs cell cycle change by RhoA-p27 pathway, which may lead to the increase of p27 protein expression in HSCs.
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2237196