【摘要】：流感病毒可在短期內(nèi)致病并迅速蔓延,其中甲型流感病毒的流行性最強(qiáng),幾乎每年都會(huì)在世界范圍內(nèi)引發(fā)不同程度的流行,危及人類健康并且造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。如今大多數(shù)甲型流感疫苗為病毒裂解疫苗、滅活疫苗或針對(duì)病毒表面抗原HA和NA的重組疫苗,但是由于表面抗原HA和NA變異很大,這些疫苗在不同亞型間的交叉保護(hù)作用受到很大的局限。M2蛋白是流感病毒顆粒表面的第三種抗原蛋白,在所有已知的不同亞型的甲型流感病毒中高度保守,自1918年流感大流行以來(lái)幾乎未發(fā)生變化。因此,M2蛋白成為了一個(gè)甲型流感廣譜疫苗的理想候選抗原。 M2蛋白在病毒顆粒包膜上呈低密度表達(dá),滅活病毒疫苗很難誘導(dǎo)出M2特異性抗體,因此低成本的原核表達(dá)系統(tǒng)成為獲得大量抗原的有效途徑。但是,M2重組蛋白的疏水性強(qiáng),在原核系統(tǒng)中難以獲得大量的表達(dá)。我們?cè)趪L試原核表達(dá)M2蛋白的過(guò)程中,意外地獲得M2蛋白突變體,在C端一段的短肽,使其在E.coli中具有很高的表達(dá)量。我們將其重新改造構(gòu)建后命名為M2MH,經(jīng)過(guò)摸索和優(yōu)化純化條件,得到了大量較高純度的重組蛋白M2MH,質(zhì)譜和電鏡結(jié)果表明M2MH形成了多聚體,提示其作為抗原,具備很好的免疫原性。 用純化的重組蛋白M2MH免疫BALB/C小鼠后,在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出高滴度的M2特異性多克隆抗血清,不僅能夠識(shí)別真核細(xì)胞表面表達(dá)的重組蛋白M2,還能夠識(shí)別甲型流感不同亞型的病毒表面抗原蛋白M2,以及被流感病毒侵染的MDCK細(xì)胞表面表達(dá)的天然蛋白M2,說(shuō)明M2MH雖有突變多肽,卻保有了很強(qiáng)的免疫原性。致死量的甲型流感病毒對(duì)免疫后的小鼠滴鼻攻擊,從小鼠的體重變化、生存率變化、肺組織病變程度幾個(gè)方面評(píng)估重組蛋白的免疫保護(hù)作用。結(jié)果表明重組蛋白能夠在動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)出一定的免疫反應(yīng),使小鼠有效抵抗病毒的攻擊,該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步利用M2MH作為抗原研制廣譜疫苗提供了依據(jù)。 另外,我們運(yùn)用雜交瘤技術(shù),成功篩選出28株穩(wěn)定分泌M2蛋白特異性的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,為甲型流感病毒感染的診斷、治療及病毒致病機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Influenza virus can cause disease and spread rapidly in a short period of time. The influenza A virus is the most prevalent in the world almost every year, it will cause different degrees of epidemic in the world, endanger human health and cause serious economic losses. Today, most influenza A vaccines are viral cleavage vaccines, inactivated vaccines or recombinant vaccines targeting virus surface antigens HA and NA, but because of the large variation in surface antigens HA and NA, The cross-protection of these vaccines between different subtypes is greatly limited. M2 protein is the third antigen protein on the surface of influenza virus particles and is highly conserved in all known subtypes of influenza A viruses. Little has changed since the 1918 influenza pandemic. Therefore, M 2 protein has become an ideal candidate antigen for influenza A wide spectrum vaccine. M 2 protein is expressed in low density on the coating of virus particles, so it is difficult to induce M2 specific antibody by inactivated virus vaccine. Therefore, low-cost prokaryotic expression system has become an effective way to obtain a large number of antigens. However, the M 2 recombinant protein is so hydrophobic that it is difficult to express in prokaryotic system. In the process of prokaryotic expression of M2 protein, we accidentally obtained the mutant M2 protein, a short peptide in C-terminal, which makes it have a high expression level in E.coli. The recombinant protein M2MH with high purity was obtained by optimizing the purification conditions. The results of mass spectrometry and electron microscopy showed that M2MH formed a polymer, which indicated that it was an antigen and had good immunogenicity. After immunizing BALB/C mice with purified recombinant protein M2MH, a high titer M2 specific polyclonal antiserum was induced in mice. It can recognize not only the recombinant protein M2 expressed on the surface of eukaryotic cells, but also the virus surface antigen protein M2 of different subtypes of influenza A, and the natural protein M2 expressed on the surface of MDCK cells infected by influenza virus, indicating that M2MH has mutated polypeptides. But it retains a strong immunogenicity. The immune protective effect of recombinant protein was evaluated from the changes of body weight, survival rate and lung tissue pathological changes in mice after immunization with lethal influenza A virus. The results showed that the recombinant protein could induce a certain immune response in animals and make mice resist the attack of virus effectively. The results provided a basis for the further development of wide-spectrum vaccine using M2MH as antigen. In addition, we successfully screened 28 hybridoma cell lines secreting monoclonal antibody against M2 protein by using hybridoma technique, which laid a foundation for the diagnosis, treatment and pathogenesis of influenza A virus infection.
【學(xué)位授予單位】：清華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2233683