【摘要】：目的 研究蛋白激酶C-α(PKC-α)對(duì)內(nèi)髓集合管上皮細(xì)胞系(mIMCD3)骨架actin的影響,初步探討PKC-α在集合管對(duì)尿液物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的作用機(jī)制及意義。 方法 常規(guī)體外培養(yǎng)mIMCD3細(xì)胞,提取四種不同的PKC-α基因的重組體,脂質(zhì)體介導(dǎo)其轉(zhuǎn)染入mIMCD3細(xì)胞,用PKC-α基因的表達(dá)載體抗性基因藥物G418篩選后獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞,隨機(jī)分為①空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(K組):轉(zhuǎn)染PKC-α基因空質(zhì)粒重組體的細(xì)胞②野生型轉(zhuǎn)染組(W組):轉(zhuǎn)染PKC-α基因野生型質(zhì)粒重組體的細(xì)胞③顯性激活型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(A組):轉(zhuǎn)染PKC-α基因顯性激活型質(zhì)粒重組體的細(xì)胞④顯性滅活型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(R組):轉(zhuǎn)染PKC-α基因顯性滅活型質(zhì)粒重組體的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24h顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光表達(dá)情況,評(píng)估轉(zhuǎn)染效率;轉(zhuǎn)染后72h細(xì)胞用含有G418藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng),并最終獲得穩(wěn)定表達(dá)PKC-α基因的細(xì)胞。Real-time實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)上述各組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的PKC-αmRNA表達(dá)水平變化,western blot檢測(cè)各組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中PKC-α蛋白表達(dá)及其活性,細(xì)胞免疫化學(xué)方法檢測(cè)各組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞骨架actin的結(jié)構(gòu)變化。 結(jié)果 ⑴成功獲取了穩(wěn)定表達(dá)不同PKC-α基因重組體的mIMCD3細(xì)胞系。⑵熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后24h細(xì)胞熒光表達(dá)情況,轉(zhuǎn)染效率平均為36±2%。⑶Real-time熒光定量PCR結(jié)果顯示:A組、W及R組PKC-αmRNA表達(dá)較K組明顯升高(p0.05),而A組、W及R組三組間比較,變化不明顯(p0.05)。western blot結(jié)果顯示:A組、R組及W組PKC-α蛋白表達(dá)較K組明顯升高(p0.05),而W組、A組與R組三組間比較,沒(méi)有明顯差別(p0.05);PKC-活性檢測(cè)顯示A組與其它三組比較活性明顯升高(p0.05),R組活性較其它組明顯下降(p0.05)。⑷細(xì)胞免疫化學(xué)顯示:K組及W組主要分布在細(xì)胞頂膜周邊,兩組間沒(méi)有較大區(qū)別,而A組同其它組相比, actin向細(xì)胞頂膜聚集增多,細(xì)胞內(nèi)相對(duì)較少;R組同其它組相比,actin主要集中于細(xì)胞內(nèi),且分布紊亂,細(xì)胞頂膜看不到正常的骨架結(jié)構(gòu)環(huán)。 結(jié)論 PKC-α影響mIMCD3骨架actin的解聚和重新分布, actin的這種變化有可能影響集合管上皮細(xì)胞的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。
[Abstract]:Objective to study the effect of protein kinase C- 偽 (PKC- 偽) on skeleton actin of inner medullary collecting duct epithelial cell (mIMCD3), and to explore the mechanism and significance of PKC- 偽 in urine transport. Methods mIMCD3 cells were cultured in vitro, four kinds of recombinant PKC- 偽 gene were extracted and transfected into mIMCD3 cells mediated by liposome. Stable transfection cells were obtained by G418 screening. Randomly divided into 1 empty plasmid transfection group (K group): cell 2 wild-type transfection group (W group) transfected with empty plasmid recombinant of PKC- 偽 gene; cell 3 dominant activated plasmid transfection group (A group) transfected PKC- 偽 gene wild-type plasmid recombinant: transfection group (A group). Cell 4 dominant inactivated plasmid transfection group (R group) of PKC- 偽 gene dominant activated plasmid: cells transfected with PKC- 偽 dominant inactivated plasmid recombinant. The fluorescent expression of transfected cells was observed under microscope 24 hours after transfection and the transfection efficiency was evaluated. Finally, the stable expression of PKC- 偽 gene in the cells. Real-time real-time quantitative PCR was obtained to detect the expression of PKC- 偽 mRNA in the above groups. Western blot was used to detect the expression and activity of PKC- 偽 protein in the cells. The structural changes of actin in stable cytoskeleton were detected by immunocytochemistry. Results (1) the fluorescent expression of different PKC- 偽 gene expression in mIMCD3 cell line was observed under fluorescence microscope 24 hours after transfection. The average transfection efficiency was 36 鹵2%.3Real-time. The results of fluorescence quantitative PCR showed that the expression of PKC- 偽 mRNA in group W and R was significantly higher than that in group K (p0. 05), while the expression of PKC- 偽 mRNA in group A and group R was significantly higher than that in group K (p0. 05). The results of western blot showed that the expression of PKC- 偽 protein in W and R groups was significantly higher than that in K group (p0.05), but the expression of PKC- 偽 protein in W group was significantly higher than that in R group (p0.05), while the expression of PKC- 偽 protein in W group was significantly higher than that in Group K group (p0.05). No significant difference (p0.05) in PKC- activity showed that the activity of group A was significantly higher than that of the other three groups (p0.05). The activity of group A was significantly lower than that of other groups (p0.05). 4. The cytoimmunochemistry showed that group K and group W were mainly distributed around the apical membrane, and there was no significant difference between the two groups. Compared with other groups, the concentration of actin to the apical membrane in group A was higher than that in other groups. In group R, the concentration of actin in cells was mainly concentrated in the cells, and the distribution of actin was disordered. There was no normal cytoskeletal structure ring in the apical membrane of group A. Conclusion PKC- 偽 affects the depolymerization and redistribution of actin in mIMCD3 skeleton, and this change of actin may affect the material transport of collecting duct epithelial cells.
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R341

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本文編號(hào)：2227160