【摘要】： 背景: 組織工程技術(shù)以少量的種子細(xì)胞經(jīng)體外擴(kuò)增后與生物材料結(jié)合,修復(fù)較大的組織或器官缺損,重建缺損部位的生理功能,為臨床上解決組織缺損等難題提供了一條新途徑,近來(lái)受到廣泛關(guān)注。 如何獲得來(lái)源廣泛、充足的種子細(xì)胞是此項(xiàng)技術(shù)的關(guān)鍵。成體干細(xì)胞來(lái)源廣泛、功能良好,是種子細(xì)胞的研究重點(diǎn)。成體干細(xì)胞可來(lái)源于骨髓、脂肪、皮膚、肌肉等各類(lèi)組織,其中骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),發(fā)現(xiàn)早、取材方便、創(chuàng)傷小,被研究的最多。隨著研究的普及和深入,脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞(ADSCs)逐漸被人們認(rèn)識(shí),與BMSCs相比,ADSCs在體內(nèi)分布更廣,可利用的細(xì)胞量更多。ADSCs自1994年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)已證實(shí)能向多種類(lèi)型的細(xì)胞分化,并且具有取材方便、創(chuàng)傷小而細(xì)胞獲得量大、病人易于接受的優(yōu)勢(shì),在組織工程的研究和應(yīng)用中顯示出了巨大的潛力。 目前普遍認(rèn)為,常用方法分離出的ADSCs是由多種分化潛能不同的細(xì)胞亞群以及大量的混雜細(xì)胞組成的混合群體,其中只有部分能夠形成脂肪細(xì)胞,因而必然會(huì)影響其構(gòu)建脂肪組織的成功率。如何提高從脂肪組織中提取干細(xì)胞的純度和尋找確認(rèn)干細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)記等問(wèn)題一直是目前急于解決的難題之一。雖然對(duì)于ADSCs的表面抗原的研究已有諸多報(bào)道,但有關(guān)ADSCs的特異性表面標(biāo)志仍無(wú)統(tǒng)一認(rèn)識(shí),對(duì)于特定分化潛能和標(biāo)志物表達(dá)之間是否存在關(guān)聯(lián)至今尚未見(jiàn)有報(bào)道。此外,有關(guān)用于純化細(xì)胞群獲得單細(xì)胞的克隆形成試驗(yàn),國(guó)外雖有利用環(huán)克隆的方法從脂肪來(lái)源細(xì)胞中分離培養(yǎng)出分化潛能不同的多種細(xì)胞克隆,但未對(duì)其進(jìn)行相關(guān)表面抗原的分析,國(guó)內(nèi)也未見(jiàn)有用此種方法進(jìn)行干細(xì)胞研究的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)單克隆培養(yǎng)的方法,分離純化出由單一細(xì)胞形成的細(xì)胞克隆,達(dá)到純化脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞的目的,并檢測(cè)其表面抗原的表達(dá),同時(shí)針對(duì)不同克隆鑒定其成脂分化的潛力,并檢測(cè)了成脂誘導(dǎo)劑對(duì)ADSCs部分相關(guān)表面抗原表達(dá)的影響,尋找ADSCs成脂分化潛能和表面抗原表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)。為ADSCs在脂肪組織工程中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 目的: 1.提取人體皮下脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞(ADSCs)進(jìn)行單克隆培養(yǎng)和擴(kuò)增,以獲得單克隆ADSCs,并鑒定不同克隆細(xì)胞的干細(xì)胞相關(guān)表面抗原表達(dá)。 2.針對(duì)不同克隆ADSCs通過(guò)對(duì)其生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、形態(tài)學(xué)、成脂分化能力等方面的特征進(jìn)行鑒定比較,探索ADSCs成脂分化潛能和表面抗原表達(dá)之間的關(guān)聯(lián),尋找代表定向成脂分化亞群的細(xì)胞標(biāo)志,從而提高構(gòu)建脂肪組織的成功率。 3.對(duì)比成脂誘導(dǎo)前后ADSCs部分相關(guān)表面抗原表達(dá)的變化,研究成脂誘導(dǎo)劑對(duì)ADSCs部分相關(guān)表面抗原表達(dá)的影響,為ADSCs在脂肪組織工程中的應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法: 臨床手術(shù)切取脂肪組織,經(jīng)膠原酶消化法原代培養(yǎng),細(xì)胞培養(yǎng)并傳至第2代后,有限稀釋法進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)。針對(duì)獲得的單克隆ADSCs,觀察其在體外培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特點(diǎn),并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同克隆CD29、CD34、CD44、CD54、CD106、ABCG2的表達(dá)。各克隆分別進(jìn)行成脂誘導(dǎo),油紅O染色鑒定分化潛能。第3代的ADSCs細(xì)胞分別于成脂誘導(dǎo)7天前、后檢測(cè)其CD34、CD54、CD106的表達(dá)。第4代ADSCs進(jìn)行成脂、成骨定向誘導(dǎo)分化,油紅“O”染色、茜素紅染色定性。 結(jié)果: 從皮下切取的脂肪組織中能培養(yǎng)出大量的ADSCs,通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)共獲得10個(gè)單克隆細(xì)胞群,不同克隆細(xì)胞在形態(tài)及增殖活力上存在差異,細(xì)胞群擴(kuò)增到第9～11代后可獲得細(xì)胞數(shù)2×10~6,進(jìn)行后續(xù)研究及凍存。干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志檢測(cè)顯示:各個(gè)克隆群體均高表達(dá)CD29(92.9±7.4%)、CD44(94.6±6.8%):低表達(dá)ABCG2(2.5±1.4%);但CD34、CD54和CD106的表達(dá)在不同群體間有明顯差異。不同克隆的成脂分化潛力明顯不同,油紅“O”染色可見(jiàn)部分含紅染顆粒的陽(yáng)性細(xì)胞高達(dá)60%,部分為陰性結(jié)果,說(shuō)明ADSCs中存在成脂分化能力不同的細(xì)胞群。第3代ADSCs在成脂誘導(dǎo)7天后CD34、CD54和CD106的表達(dá)較誘導(dǎo)之前無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ADSCs成脂誘導(dǎo)分化兩周,可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)有大量脂滴,油紅“O”染色可見(jiàn)胞漿內(nèi)有大量紅染顆粒;成骨誘導(dǎo)分化兩周可肉眼看到白色礦化的顆粒狀鈣鹽沉積,經(jīng)茜素紅染色鑒定可發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞及鈣鹽沉積被紅染。 結(jié)論: 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明:皮下脂肪組織經(jīng)過(guò)酶消化原代培養(yǎng)可提取有多向分化能力的干細(xì)胞,通過(guò)克隆形成試驗(yàn)培養(yǎng)的方法可以純化ADSCs,獲得高純度具有間充質(zhì)細(xì)胞特性的細(xì)胞群,體外多次傳代、長(zhǎng)期培養(yǎng)并不改變細(xì)胞形態(tài)和增殖活性。不同的單克隆細(xì)胞群之間表面標(biāo)志的表達(dá)和成脂分化能力存在共性和差異。差異較顯著的CD34及CD54可能作為ADSCs中高成脂分化細(xì)胞群純化和分選的標(biāo)志。另外,在成脂分化后CD34、CD54和CD106的表達(dá)較之前無(wú)顯著性差異,與傳代培養(yǎng)后的下降變化不同,也提示了這些抗原可能的標(biāo)識(shí)作用。但尚不能認(rèn)為這些標(biāo)志物和分化能力之間存在線(xiàn)性關(guān)系。后續(xù)研究應(yīng)當(dāng)對(duì)這些標(biāo)志物進(jìn)行鑒定,以明確其與成脂分化之間的聯(lián)系,建立脂肪組織來(lái)源基質(zhì)細(xì)胞的純化技術(shù),為ADSCs構(gòu)建脂肪組織填充物實(shí)現(xiàn)組織工程修復(fù)缺損奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[Abstract]:Background:
Tissue engineering technology, which combines a small amount of seed cells with biomaterials after in vitro amplification, repairs large tissue or organ defects and reconstructs the physiological function of the defect site, provides a new way to solve the problems of tissue defect in clinic, and has attracted wide attention recently.
Adult stem cells can be derived from bone marrow, adipose tissue, skin, muscle and other tissues, including bone marrow stromal cells (BMSCs), which are found early, easy to obtain materials, minimally invasive and the most studied. With the popularization and deepening of research, adipose tissue-derived stem cells (ADSCs) have been gradually recognized by people. Compared with BMSCs, ADSCs are more widely distributed in the body and have more available cells. The advantages of acceptance show great potential in the research and application of tissue engineering.
It is generally believed that ADSCs isolated by common methods are a mixed group of cells with different differentiation potentials and a large number of mixed cells. Only some of them can form adipocytes, which will inevitably affect the success rate of adipose tissue construction. How to improve the purity and purity of stem cells extracted from adipose tissue Finding markers for identifying stem cells has been one of the most pressing problems. Although there have been many reports on the surface antigens of ADSCs, there is still no consensus on the specific surface markers of ADSCs. In addition, many cell clones with different differentiation potentials have been isolated and cultured from adipose-derived cells by cyclic cloning, but no analysis of the related surface antigens has been made. There is no report on the use of this method for stem cell research in China. In order to purify adipose tissue-derived stem cells and detect the expression of their surface antigens, the potential of adipogenic differentiation was identified according to different clones, and the effect of adipogenic inducers on the expression of some surface antigens of ADSCs was detected. To explore the relationship between adipogenic differentiation potential and surface antigen expression of ADSCs and provide experimental basis for the application of ADSCs in adipose tissue engineering.
Objective:
1. Subcutaneous adipose tissue-derived stem cells (ADSCs) were extracted from human adipose tissue for monoclonal culture and amplification to obtain monoclonal ADSCs and to identify the expression of stem cell-related surface antigens in different cloned cells.
2. By identifying and comparing the growth kinetics, morphology and adipogenic differentiation ability of different clones of ADSCs, the relationship between adipogenic differentiation potential and surface antigen expression of ADSCs was explored, and the cell markers representing the adipogenic differentiation subgroup were found to improve the success rate of adipose tissue construction.
3. To compare the expression of ADSCs related surface antigens before and after adipogenic induction, and to study the effect of adipogenic inducers on the expression of ADSCs related surface antigens, so as to lay an experimental foundation for the application of ADSCs in adipose tissue engineering.
Method:
Adipose tissue was harvested and cultured by collagenase digestion. Cells were cultured and passed to the second generation. The morphological and biological characteristics of monoclonal ADSCs were observed in vitro. The expression of CD29, CD34, CD44, CD54, CD106 and ABCG2 were detected by flow cytometry. The expression of CD34, CD54 and CD106 in ADSCs of the 3rd generation was detected before and 7 days after the induction of adipogenesis. The 4th generation ADSCs were adipogenesis, osteogenic differentiation was induced, oil red "O" staining and alizarin red staining were used to characterize.
Result:
A large number of ADSCs can be cultured from subcutaneous adipose tissue. A total of 10 monoclonal cell groups were obtained by clone formation test. The morphological and proliferative activities of different clonal cells were different. The number of ADSCs was 2 CD29 was overexpressed in all clones, CD44 was underexpressed in ABCG2 (2.5+1.4%) and CD34, CD54 and CD106 were significantly different in different populations. The expression of CD34, CD54 and CD106 in ADSCs of the third generation had no significant difference after 7 days of adipogenesis induction compared with that before induction. Alizarin red staining showed that osteoblasts and calcium salt deposits were stained red.
Conclusion:
The results of this experiment showed that the subcutaneous adipose tissue could be digested by enzymatic digestion and cultured to extract multipotent stem cells. ADSCs could be purified by clone formation test. High purity cells with mesenchymal characteristics could be obtained. The cells were subcultured in vitro for many times. Long-term culture did not change the morphology and proliferative activity of the cells. There are similarities and differences in the expression of surface markers and the ability of adipogenic differentiation among the monoclonal cell populations. CD34 and CD54 with significant differences may be used as markers for the purification and sorting of highly adipogenic cell populations in ADSCs. These markers should be identified in order to clarify the relationship between these markers and adipogenic differentiation, establish purification technology of adipose tissue-derived stromal cells, and construct adipose tissue for ADSCs. The experimental basis for filling tissue to repair defects of tissue engineering is established.
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2224402