大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧凋亡機(jī)制探討及Akt基因?qū)ζ淙毖醯蛲龅挠绊?/H1>

發(fā)布時(shí)間：2018-08-31 12:48

【摘要】： 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)自我復(fù)制性、非特異弱免疫原性以及可向心肌、神經(jīng)元、內(nèi)皮等不同胚層細(xì)胞分化的多潛能性等使其成為當(dāng)今心腦血管等領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。心肌細(xì)胞成形治療(celularcardiomyoplasty,CCM)研究發(fā)現(xiàn):MSCs尤其是骨髓MSCs可能通過分化成功能性心肌細(xì)胞、刺激梗死區(qū)血管新生、提高神經(jīng)密度、增強(qiáng)心肌厚度和彈性、分泌細(xì)胞因子或表達(dá)細(xì)胞因子受體、抑制心肌細(xì)胞凋亡和防治心肌重構(gòu)等機(jī)制而使CCM成為當(dāng)今熱點(diǎn),不過,許多CCM報(bào)告圖片顯示:1.直接注入到心肌梗死區(qū)的標(biāo)記MSCs僅散在分布于分化良好、結(jié)構(gòu)完整的大血管壁內(nèi)和成熟心肌之間而不在或偶在肉芽組織替代的梗死區(qū)(此區(qū)域內(nèi)血管稀少,血液供應(yīng)最差)和其毛細(xì)血管周圍(原缺血區(qū),血液供應(yīng)較差)出現(xiàn),更沒有足夠多的細(xì)胞數(shù)目替代瘢痕組織;2.標(biāo)記細(xì)胞散在分布于正常組織、細(xì)胞之間而不似培養(yǎng)條件下以種子細(xì)胞為中心的擴(kuò)展性生長;3.瘢痕組織中動(dòng)脈和小動(dòng)脈密度不增加,而毛細(xì)血管密度的增加并不足以改善局部區(qū)域血流;4.MSCs在梗死區(qū)域并不充分出現(xiàn)心肌細(xì)胞表型等;這些結(jié)果提示區(qū)域性缺氧環(huán)境不利于MSCs生存、增殖和分化等,其原因是否因?yàn)檫@些區(qū)域的缺氧環(huán)境不利于MSCs增殖、分化甚至導(dǎo)致其凋亡、死亡等國內(nèi)外罕見報(bào)道。如果缺氧可導(dǎo)致MSCs凋亡,那么缺氧是否可致骨髓MSCs表達(dá)Bax、Bcl—2、Fas-L、Fas、Caspase-3等凋亡相關(guān)mRNA和蛋白以及它們在MSCs凋亡中所起的作用如何等迄今亦罕見研究。參予介導(dǎo)細(xì)胞生長、增殖的Akt蛋白既是細(xì)胞存活的信號介質(zhì)又是細(xì)胞存活的必要因素,持續(xù)存在可以避免細(xì)胞損傷,那么Akt基因轉(zhuǎn)染骨髓MSCs是否可減輕MSCs缺氧凋亡和提高缺氧時(shí)MSCs增殖能力(即耐缺氧能力)尚不清楚。鑒于此,本研究擬對體外培養(yǎng)的第三代(Passage 3,P_3)Wistar大鼠骨髓MSCs在缺氧箱(94%N_2、1%O_2和5%CO_2)中孵育,探討下述三個(gè)方面:1.缺氧不同時(shí)間點(diǎn)對MSCs凋亡和增殖等的影響,明確心肌梗死后移植的MSCs能否在相對缺氧的移植區(qū)生存,為CCM成功實(shí)現(xiàn)提供新思維;2.MSCs在缺氧環(huán)境下凋亡相關(guān)mRNA和蛋白與凋亡的相關(guān)性,確立其是否在骨髓MSCs缺氧凋亡中發(fā)揮作用; 3.探討Akt基因是否提高M(jìn)SCs耐缺氧能力,從而為更佳的CCM效應(yīng)提供理論依據(jù)。另外,在這些研究的基礎(chǔ)上,我們對Akt-MSCs是否可調(diào)整心臟交感神經(jīng)和膽堿能神經(jīng)以及促進(jìn)神經(jīng)纖維再生進(jìn)行了初步探討。 論文一:缺氧對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡、增殖和超微結(jié)構(gòu)的影響 目的 探討梯度離心貼壁法培養(yǎng)的大鼠骨髓單核細(xì)胞是否MSCs以及缺氧對其凋亡、增殖和超微結(jié)構(gòu)的影響。 方法 1.無菌條件下取出Wistar大鼠股骨及脛骨骨髓,于Percoll(比重1.074g/mL和1.070g/mL)分離液上梯度離心(500g,20 mins)后取界面層細(xì)胞培養(yǎng)、傳代。將P3 MSCs免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定CD29、CD34、CD44和CD71受體,5-aza(濃度10umol/L)培養(yǎng)液常規(guī)孵育2周后肌鈣蛋白T(troponin,Tn T)表達(dá)和H-DMEM成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液(DEX 100nmol/L,β-GP 10mmol/L,AsA0.25mmol/L)常規(guī)孵育2周后ALP表達(dá)。 2.將P3 MSCs置于94%N_2、1%O_2和5%CO_2缺氧箱中37℃孵育不同時(shí)間點(diǎn)(常氧、缺氧0.5 h、1h、2 h、4 h和8 h)。 3.應(yīng)用Annexin V/PI雙染法進(jìn)行流式細(xì)胞儀(flow cytometry,FCM)分析MSCs凋亡率(Apoptotic Rate,AR)和死亡率(dead rate,DR)、應(yīng)用四唑鹽比色試驗(yàn)(MTT比色試驗(yàn))分析細(xì)胞增殖狀態(tài)以及透射電鏡觀察MSCs缺氧時(shí)超微結(jié)構(gòu)改變。 結(jié)果 1.骨髓單核細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定CD29、CD44和CD71免疫細(xì)胞化學(xué)染色均可見棕黃色顆粒沉積于胞膜,而CD34免疫細(xì)胞化學(xué)染色后未見棕黃色顆粒沉積于胞膜;5-aza誘導(dǎo)后Tn T免疫細(xì)胞化學(xué)染色可見棕黃色顆粒沉積胞質(zhì)中,成骨誘導(dǎo)后改良Gomori法染色可見胞漿內(nèi)深褐色甚或黑色顆粒呈片狀沉積。 2.MSCs不同缺氧時(shí)間點(diǎn)AR和DR MSCs常氧、缺氧0.5 h、1 h、2 h、4 h、和8 h時(shí)的AR均較缺氧前顯著增高(P＜0.01)、DR亦顯著增高(P＜0.05),不過,隨著缺氧時(shí)間延伸,AR顯著增加(P＜0.05),而DR沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 3.MSCs不同缺氧時(shí)間點(diǎn)增殖狀態(tài)缺氧不同時(shí)間點(diǎn)MTT法0D值較常氧(缺氧結(jié)束同步時(shí)間點(diǎn))均顯著性降低(P＜0.01),并隨缺氧時(shí)間延伸顯著降低(P＜0.05),不過,與常氧(缺氧開始時(shí)間點(diǎn))相比,均顯著升高(P＜0.05)。 4.缺氧對MSCs超微結(jié)構(gòu)的影響常氧時(shí),MSCs呈卵圓形或不規(guī)則多邊形等,表面微絨毛較多且向細(xì)胞內(nèi)凹陷,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和游離核糖體較豐富而線粒體小,多為單核,雙核偶見,核仁大而形態(tài)不規(guī)則,可見核裂。缺氧0.5 h即見微絨毛脫落、胞漿空泡化、線粒體腫脹等,缺氧4 h可見腫脹線粒體(伴嵴消失)明顯增多。 討論 MSCs在骨髓中含量極低,而其鑒定必須具有骨髓來源、體外培養(yǎng)貼附于培養(yǎng)皿上且形態(tài)呈成纖維樣集落形成單位(colony forming unit,CFU-F)和能夠自主增殖至少分化為三種以上間質(zhì)細(xì)胞系等特性逆推得知是否為MSCs。我們通過梯度離心貼壁法培養(yǎng)的骨髓單核細(xì)胞具有MSCs的生長特性并且5-aza誘導(dǎo)后形態(tài)學(xué)接近心肌細(xì)胞并表達(dá)Tn T蛋白提示向心肌樣細(xì)胞分化、成骨誘導(dǎo)后形態(tài)學(xué)發(fā)生改變并表達(dá)ALP提示向成骨細(xì)胞分化,所有這些特征均支持我們采用梯度離心貼壁法所培養(yǎng)的骨髓單核細(xì)胞是骨髓MSCs。MSCs不同缺氧時(shí)間點(diǎn)AR、DR較缺氧前均顯著性增高提示缺氧可誘導(dǎo)MSCs凋亡、死亡,不過,缺氧0.5 h時(shí)AR即顯著、迅速增高而隨著缺氧時(shí)間延伸,MSCs AR和DR卻呈緩慢上升趨勢的結(jié)果提示MSCs在進(jìn)入缺氧環(huán)境后即刻的不適應(yīng)性以及其隨著缺氧時(shí)間延伸而可能適應(yīng)缺氧狀態(tài),“死亡”可能是MSCs凋亡的后期表現(xiàn)。結(jié)果3提示MSCs于缺氧時(shí)仍可增殖但其“增殖”滯緩。總之,我們的研究顯示缺氧可導(dǎo)致MSCs凋亡、增殖滯緩及超微結(jié)構(gòu)改變,而MSCs凋亡及增殖滯緩可能是移植的MSCs難以在心肌梗死后相對缺氧的移植區(qū)生存、增殖和分化等原因之一。 結(jié)論 梯度離心貼壁法培養(yǎng)的骨髓單核細(xì)胞是骨髓MSCs;缺氧可引起MSCs凋亡、增殖滯緩及超微結(jié)構(gòu)改變。 論文二:缺氧環(huán)境下大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá) 目的 探討MSCs在缺氧環(huán)境下凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)以及它們在凋亡中的潛在作用。 方法 1.將接種的P_3 MSCs置于94%N_2、1%O_2和5%CO_2缺氧箱中37℃孵育。 2.分別于0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h和12 h取出。 3.應(yīng)用Annexin V/PI雙染法FCM分析MSCs凋亡率(AR)和死亡率(DR)。 4.免疫細(xì)胞化學(xué)、Rt-PCR和western blotting檢測Bax/Bcl-2,Fas/FasL和Caspase-3 mRNA和蛋白的表達(dá)。 5.分析AR與凋亡相關(guān)mRNA和蛋白相關(guān)性。 結(jié)果 1.缺氧前,免疫細(xì)胞化學(xué)法未檢測到Bcl-2、Bax、Fas和Fas L蛋白表達(dá),缺氧0.5 h后均可較強(qiáng)表達(dá),各缺氧時(shí)間點(diǎn)Caspase-3表達(dá)率較常氧顯著增加。 2.各缺氧時(shí)間點(diǎn)Bcl-2、Bax、Fas、Fas L、Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)較缺氧前均顯著增高(P均＜0.05);隨缺氧時(shí)間延伸,Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)不顯著增加(P＞0.05),而Bax、Fas、Fas L、Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著增加(P均＜0.05),但缺氧6 h～12 h時(shí)間點(diǎn)之間表達(dá)均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)。 3.AR和Bcl-2/Bax mRNA(r_1=-0.435,P=0.040)及蛋白(r_2=-0.417,P=0.043)呈顯著負(fù)相關(guān),而和Fas(r_1=0.711,P=0.018:r_2=0.639,P=0.025)、Fas-L(r_1=0.605,P=0.037;r_2=0.581,P=0.022)、Caspase-3(r_1=0.657,P=0.026;r_2=0.704,P=0.014)mRNA及蛋白均呈顯著正相關(guān)。 討論 在細(xì)胞凋亡過程中,Bcl-2基因?yàn)榭沟蛲龌?而Bax基因?yàn)榇俚蛲龌�。在常�?大鼠MSCs不表達(dá)Bcl-2、Bax mRNA和蛋白,而在本缺氧條件下,二者均表達(dá)增強(qiáng),并且Bcl-2/Bax與AR顯著負(fù)相關(guān),提示Bcl-2、Bax mRNA和蛋白可能參予MSCs缺氧時(shí)的凋亡調(diào)控,并且Bax mRNA和蛋白可能促進(jìn)凋亡、而Bcl-2 mRNA和蛋白抑制凋亡。Fas及其配體Fas-L共同參予調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程,在常氧,MSCs不表達(dá)Fas-L、Fas mRNA和蛋白,而在本缺氧條件下,二者均表達(dá)增強(qiáng),并且Fas、Fas-L mRNA和蛋白均與AR顯著正相關(guān),提示Fas-L、Fas mRNA和蛋白參予并可能促進(jìn)MSCs的缺氧凋亡調(diào)控。細(xì)胞凋亡信號途徑中最關(guān)鍵的效應(yīng)酶caspase-3在細(xì)胞凋亡過程中處于核心位置,在本缺氧條件下,caspase-3 mRNA和蛋白均與AR顯著正相關(guān),提示caspase-3 mRNA和蛋白參予MSCs缺氧凋亡的調(diào)控�？傊�,我們研究提示MSCs在缺氧狀態(tài)下發(fā)生凋亡的過程中,線粒體途徑和受體途徑均參予細(xì)胞凋亡,并且可能呈caspase-3依賴性凋亡。 結(jié)論 在缺氧促進(jìn)MSCs凋亡過程中,Bcl-2 mRNA和蛋白可能起著保護(hù)作用,而Bax、Fas-L、Fas、Caspase-3 mRNA和蛋白可能在MSCs凋亡的進(jìn)程中起著促進(jìn)作用。 論文三:Akt基因轉(zhuǎn)染對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧時(shí)凋亡和增殖的影響 目的 探討Akt基因是否改善MSCs耐缺氧能力。 方法 將轉(zhuǎn)染Akt基因和未轉(zhuǎn)染Akt基因的MSCs置于94%N_2、1%O_2和5%CO_2缺氧箱中37℃孵育不同時(shí)間點(diǎn)(常氧、缺氧0.5 h、1h、2 h、4 h和8 h)。Annexin V/PI雙染法FCM分析MSCs AR和DR。應(yīng)用MTT比色試驗(yàn)分析細(xì)胞增殖狀態(tài)。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色、Rt-PCR和western blot檢測Akt和p-Akt表達(dá)。 結(jié)果 1.Akt基因顯著降低MSCs缺氧時(shí)的AR和DR(P＜0.01),而在各缺氧時(shí)間點(diǎn)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 2.與未轉(zhuǎn)染Akt基因的MSCs比較,Akt基因顯著增高M(jìn)SCs常氧培養(yǎng)條件下(P＜0.01)和缺氧培養(yǎng)條件下的增殖能力(P＜0.01);轉(zhuǎn)染Akt基因的MSCs缺氧時(shí)的增殖能力顯著低于其在常氧培養(yǎng)時(shí)的增殖能力(P＜0.01)。 3.轉(zhuǎn)染Akt基因顯著增高常氧培養(yǎng)條件下MSCs Akt mRNA(P＜0.01)和蛋白(P＜0.01)表達(dá),而并不增高p-Akt mRNA(P＞0.05)和蛋白(P＞0.05)的表達(dá);在常氧、缺氧時(shí)Akt mRNA(P＞0.05)和蛋白(P＞0.05)表達(dá)均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而提高缺氧時(shí)p-Akt mRNA(P＜0.01)和蛋白(P＜0.01)表達(dá);在缺氧前、后,免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法均可檢測到轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染Akt基因MSCs表達(dá)Akt和p-Akt蛋白。 討論 MSCs轉(zhuǎn)染Akt基因后在常氧時(shí)可顯著增高Akt mRNA和蛋白表達(dá),而不改變p-Akt蛋白表達(dá),一旦暴露于缺氧環(huán)境可同時(shí)顯著提高Akt mRNA和蛋白及p-Akt蛋白表達(dá)等可能是由于轉(zhuǎn)染Akt基因的MSCs在尚未得到缺氧刺激時(shí)不能充分“觸發(fā)”Akt蛋白磷酸化或其功能已足夠滿足細(xì)胞生存需求而“負(fù)反饋”抑制其磷酸化,當(dāng)“缺氧”刺激時(shí)即可“觸發(fā)”Akt蛋白磷酸化即產(chǎn)生p-Akt。Akt基因可顯著降低MSCs在各缺氧時(shí)間點(diǎn)的AR和DR提示Akt基因可提高M(jìn)SCs耐缺氧能力。不過,常氧培養(yǎng)條件下,轉(zhuǎn)染Akt基因并不影響MSCs的AR和DR提示常氧狀態(tài)下Akt的作用已能夠滿足MSCs生存、增殖,而過多表達(dá)并不在抗細(xì)胞凋亡中發(fā)生作用;MSCs缺氧培養(yǎng)較常氧培養(yǎng)的AR和DR仍然升高提示缺氧可能通過其它機(jī)制引起MSCs凋亡,而Akt基因轉(zhuǎn)染并不足夠完全抑制細(xì)胞凋亡。總之,研究提示Akt基因轉(zhuǎn)染MSCs可顯著提高M(jìn)SCs耐缺氧能力,此可能是轉(zhuǎn)染Akt基因MSCs的CCM效應(yīng)較單純MSCs的CCM效應(yīng)更佳化的原因之一。 結(jié)論 Akt基因轉(zhuǎn)染可顯著提高M(jìn)SCs耐缺氧能力 論文四:Akt基因轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細(xì)胞對阿霉素誘導(dǎo)的慢性心力衰竭的心臟神經(jīng)的保護(hù)作用 目的 Akt-MSCs是否可調(diào)整心臟交感神經(jīng)和膽堿能神經(jīng)以及促進(jìn)神經(jīng)纖維再生。 方法 阿霉素誘導(dǎo)慢性心力衰竭模型完成后,大鼠被隨機(jī)分為Akt-MSCs組(n=11),s-MSCs(n=11)組和對照組(n=12)。各組分別經(jīng)尾靜脈給予Akt-MSCs、s-MSCs(2x106 cells in 100ul PBS)或等量PBS。第四周檢測心臟超聲、去甲腎上腺素(NE),膽堿乙�；D(zhuǎn)移酶(ChAT)、突觸素(SYN)生長相關(guān)蛋白43(GAP-43)。 結(jié)果 1.在Akt-MSCs組和s-MSCs組,死亡率和射血分?jǐn)?shù)均顯著低于對照組。 2.Akt-MSCs和s-MSCs均可顯著降低組織NE水平。 3.在Akt-MGCs組和s-MSCs組,ChAT水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但均顯著高于對照組。 4.在Akt-MSCs組和s-MSCs組,SYN或GAP-43染色陽性的神經(jīng)密度均顯著高于對照組,而以Akt-MSCs組神經(jīng)密度最高。 結(jié)論 MSCs尤其是Akt基因轉(zhuǎn)染的MSCs移植可促進(jìn)心臟神經(jīng)纖維的再生,該作用可能被GAP-43介導(dǎo)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2215032

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