【摘要】： T-2毒素是由多種真菌產(chǎn)生的單端孢霉烯族(trichothecenes,TS)毒素中最毒的毒素之一。該毒素在自然界中分布極為廣泛,是危險(xiǎn)的食品污染物,對(duì)人畜健康危害十分嚴(yán)重。為此,在本研究中,我們構(gòu)建了抗T-2毒素的噬菌體單鏈抗體庫,從中篩選親和力較高的單鏈抗體,從而為T-2毒素的檢測奠定基礎(chǔ)。此外,并對(duì)其引起的細(xì)胞毒性進(jìn)行了研究。 根據(jù)T-2毒素是小分子半抗原的特性,我們首先將T-2毒素與牛血清白蛋白BSA通過琥珀酸酐法進(jìn)行交聯(lián)使之變成完全抗原。然后用交聯(lián)物T-2HS-BSA免疫Balb/c雌性小鼠。達(dá)到一定的效價(jià)后,從小鼠的脾臟中提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈,通過PCR擴(kuò)增得到重鏈和輕鏈可變區(qū)VH、VL基因,通過重疊延伸PCR(SOE-PCR)組裝成scFv并克隆到噬菌體載體pCANTAB5E中,構(gòu)建噬菌體抗體庫。通過噬菌體展示技術(shù)經(jīng)過四輪淘選得到一株有親和力的單鏈抗體T1。 為研究T-2毒素對(duì)骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的毒性,我們通過顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化,MTT法檢測其對(duì)骨髓瘤細(xì)胞增殖抑制用,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的周期,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Caspase-3基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明,T-2毒素使骨髓瘤細(xì)胞凋亡,且呈時(shí)間和劑量依賴關(guān)系。實(shí)時(shí)定量PCR表明T-2使Caspase-3基因mRNA表達(dá)發(fā)生上調(diào)。這些結(jié)果表明,Caspase-3可能在T-2毒素誘導(dǎo)的SP2/0細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中起重要作用。
[Abstract]:T-2 toxin is one of the most toxic toxins in monosporin (trichothecenes,TS) toxin produced by many fungi. The toxin is widely distributed in nature and is a dangerous food pollutant, which is very harmful to human and animal health. Therefore, in this study, we constructed a phage scFv library against T-2 toxin, and screened scFv with high affinity from it, thus laying a foundation for the detection of T-2 toxin. In addition, the cytotoxicity was studied. According to the characteristic that T-2 toxin is a small molecule hapten, T-2 toxin and bovine serum albumin (BSA) BSA are crosslinked to complete antigen by succinic anhydride method. Then Balb/c female mice were immunized with T-2HS-BSA. After reaching a certain titer, the first strand of cDNA was obtained by reverse transcription of total RNA, from mouse spleen, and the VH,VL gene of heavy chain and light chain variable region was obtained by PCR amplification. ScFv was assembled by overlapping extension of PCR (SOE-PCR) and cloned into phage vector pCANTAB5E. The phage antibody library was constructed. A single chain antibody T 1 with affinity was obtained by phage display after four rounds of panning. In order to study the cytotoxicity of T-2 toxin to myeloma cell line SP2/0, the cell morphology was observed by microscope and the cell cycle was detected by flow cytometry. The expression of Caspase-3 gene was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. The results showed that T-2 toxin induced apoptosis of myeloma cells in a time and dose dependent manner. Real-time quantitative PCR showed that T-2 up-regulated the mRNA expression of Caspase-3 gene. These results suggest that Caspase-3 may play an important role in T-2 toxin induced apoptosis signaling pathway in SP2/0 cells.
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 董軍,黃強(qiáng),蘭青,周麗英,王愛東;PCR定點(diǎn)誘變改造低效價(jià)抗膠質(zhì)瘤單克隆抗體的初步報(bào)告[J];江蘇醫(yī)藥;2001年11期

2 章美云,楊青,趙莉,孔健;原核分泌型表達(dá)載體的構(gòu)建及癌胚抗原單鏈抗體的表達(dá)[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;1998年01期

3 王冠華,孔健;CEA單鏈抗體基因在大腸桿菌中的克隆及表達(dá)[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;1998年06期

4 王字玲,鄧健蓓,韓驊,陳萍,藥立波,蘇成芝;抗人黑色素瘤單鏈抗體基因的克隆和分泌型表達(dá)[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);1999年01期

5 楊衛(wèi)東,李彪,朱承謨,楊冠珍,吳祥甫;抗癌胚抗原單鏈抗體與核心鏈霉親和素基因的融合及在大腸桿菌的表達(dá)[J];上海免疫學(xué)雜志;2000年06期

6 廖楚航,王大章,楊西川,李揚(yáng),房思煉;抗人VEGF單鏈抗體基因的克隆及突變校正[J];實(shí)用醫(yī)院臨床雜志;2004年01期

7 唐珍潔,廖文君,余冰,鐘繼新,朱慧芬,葉慶,程欣,李文涵,沈關(guān)心;肝癌細(xì)胞特異性結(jié)合單鏈抗體三維結(jié)構(gòu)的同源模建[J];生物物理學(xué)報(bào);2005年03期

8 沈樹泉,周筱梅,黃強(qiáng),許志元,王愛東,杜子威;抗人腦膠質(zhì)瘤單克隆抗體SZ39單鏈抗體的構(gòu)建及初步表達(dá)[J];中華神經(jīng)外科雜志;1997年05期

9 季萬勝,任軍,周紹娟,費(fèi)晉秀,陳崢,喬泰東,樊代明;癌胚抗原單鏈抗體-鏈親和素融和蛋白的功能鑒定[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);1999年04期

10 王長軍,唐家琪,李先富,潘秀珍,操敏;噬菌體表面呈現(xiàn)抗人紅細(xì)胞血型A抗原單鏈抗體的研究[J];中國免疫學(xué)雜志;2000年05期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 王長軍;唐家琪;李先富;潘秀珍;操敏;;抗人紅細(xì)胞血型抗原噬菌體單鏈抗體的研究[A];面向21世紀(jì)的科技進(jìn)步與社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展（下冊(cè)）[C];1999年

2 王洪利;舒建昌;;單鏈抗體在肝臟疾病中應(yīng)用的研究進(jìn)展[A];廣東省肝臟病學(xué)會(huì)2007年年會(huì)論文集[C];2007年

3 孫娜娜;王欲曉;周麗君;王剛;;人源性抗大皰性類天皰瘡抗原BP180-NC16A單鏈抗體的構(gòu)建及表達(dá)[A];2009全國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

4 張惠中;;細(xì)胞內(nèi)生成的抗整合酶單鏈抗體阻斷HIV-1復(fù)制的實(shí)驗(yàn)研究[A];新世紀(jì) 新機(jī)遇 新挑戰(zhàn)——知識(shí)創(chuàng)新和高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展（上冊(cè)）[C];2001年

5 王欲曉;喬媛媛;周麗君;;人源性抗蓖麻單鏈抗體的分離純化和活性鑒定[A];第六屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2008年

6 汪世華;胡開輝;楊燕凌;邱君志;;基因工程單鏈抗體研究[A];2005全國第二屆核酸疫苗研討會(huì)論文集[C];2005年

7 林志偉;汪世華;王宗華;;抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇單鏈抗體(DON-ScFv)在枯草芽孢桿菌中高效表達(dá)與分泌[A];中國生物工程學(xué)會(huì)2006年學(xué)術(shù)年會(huì)暨全國生物反應(yīng)器學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2006年

8 楊燕凌;;酶(蛋白)融合技術(shù)研究[A];華東地區(qū)農(nóng)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)暨福建省科協(xié)第七屆學(xué)術(shù)年會(huì)農(nóng)業(yè)分會(huì)場論文集[C];2007年

9 陳立;宋今丹;;抗人大腸癌重組單鏈抗體的研制[A];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)第七次會(huì)議論文摘要匯編[C];1999年

10 湯永民;寧鉑濤;曹江;沈紅強(qiáng);錢柏芹;張海忠;張怡;郭莉;;抗人CD14新克隆ZCH-7-2F9單鏈抗體真核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及鑒定[A];2005年華東六省一市血液病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨浙江省血液病學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2005年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前8條

1 北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)所 康娟　劉毅;臨床檢測儀器新面孔[N];健康報(bào);2010年

2 本報(bào)記者 李建榮;雛鷹展翅向藍(lán)天[N];大眾科技報(bào);2011年

3 曹勇;方興未艾的藥物釋放領(lǐng)域[N];中國醫(yī)藥報(bào);2002年

4 ;雖是配角，，也唱得紅紅火火[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2000年

5 姜卯生;四軍醫(yī)大頜骨腫瘤研究獲成果[N];中國醫(yī)藥報(bào);2002年

6 蔡忠仁;我國海洋生物毒素檢測技術(shù)獲突破[N];中國海洋報(bào);2010年

7 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所研究員 邵榮光;高效小型化唱主角[N];健康報(bào);2010年

8 記者 李天舒;抗狂犬病毒人源抗體制備成功[N];健康報(bào);2011年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 胡學(xué)軍;抗乙肝病毒表面抗原PreS1(20-47)單鏈抗體基因克隆及其在大腸桿菌和煙草中的表達(dá)[D];大連理工大學(xué);2002年

2 田媛;前列腺癌細(xì)胞結(jié)合單鏈抗體的篩選、表達(dá)純 化及其功能初步研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2005年

3 李月紅;抗ICAM-1單克隆抗體與單鏈抗體的制備及其生物學(xué)特性研究[D];吉林大學(xué);2005年

4 陳德宇;前列腺素D合成酶在男性生殖中的基礎(chǔ)及應(yīng)用研究[D];南京師范大學(xué);2005年

5 熊盛;重組人源抗HBsAg單鏈抗體在大腸桿菌和巴氏畢赤酵母中的表達(dá)、純化與性質(zhì)鑒定[D];華南理工大學(xué);2002年

6 邵長利;抗人紅細(xì)胞單鏈抗體融合HIV-1gp41抗原肽雙功能分子的制備與鑒定[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2007年

7 萬忠海;抗PEA單抗和單鏈抗體制備及在綠膿感染中的應(yīng)用[D];吉林大學(xué);2008年

8 楊瑞梅;單鏈抗體介導(dǎo)狂犬病毒shRNA靶向制劑的研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

9 付建芳;溶藻弧菌抗獨(dú)特型抗體基因工程疫苗的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2005年

10 余自強(qiáng);抗血小板膠原受體糖蛋白VI單克隆抗體的制備和功能研究[D];蘇州大學(xué);2005年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張薇;抗T-2毒素單鏈抗體的制備及該毒素對(duì)細(xì)胞毒性影響的初步研究[D];福建農(nóng)林大學(xué);2010年

2 徐飛虎;抗肺癌單鏈抗體偶聯(lián)綠色熒光蛋白基因的構(gòu)建及表達(dá)研究[D];浙江大學(xué);2003年

3 趙蕾;抗雞傳染性支氣管炎病毒單鏈抗體原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其間接ELISA篩選方法的建立[D];上海交通大學(xué);2011年

4 王溪橋;大容量人源肝癌核糖體展示單鏈抗體庫的構(gòu)建[D];蘭州大學(xué);2010年

5 江淼;抗活化血小板表面受體全套單鏈抗體噬菌體展示文庫的構(gòu)建和篩選[D];蘇州大學(xué);2003年

6 紀(jì)秋野;抗蓖麻毒素單鏈抗體的構(gòu)建、表達(dá)、純化及功能測定[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué);2010年

7 張慶麗;抗EGFRvⅢ特異性單鏈抗體的構(gòu)建及其靶向性研究[D];南華大學(xué);2011年

8 劉曉雷;抗伏馬菌素B_1單鏈抗體的制備[D];福建農(nóng)林大學(xué);2010年

9 于穎;PRRSV GP5蛋白抗獨(dú)特型單鏈抗體的構(gòu)建表達(dá)與鑒定[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

10 劉海榮;丁香假單胞菌極毛蛋白HrpA的克隆表達(dá)與單鏈抗體的制備[D];福建農(nóng)林大學(xué);2011年

本文編號(hào)：2211296