【摘要】：水通道蛋白(aquaporins,AQPs)是一組廣泛存在于動植物細胞膜上與水轉運相關的整合蛋白,參與水分子的跨膜轉運和細胞內(nèi)外環(huán)境穩(wěn)態(tài)的調節(jié)。迄今為止,在哺乳動物組織中已鑒定出13種水通道蛋白(AQP0-AQP12)。其中,AQP4是成年動物腦內(nèi)表達量最豐富、水通透效率最高的水通道亞型,主要分布于星形膠質細胞、室管膜細胞以及成體神經(jīng)干細胞(adult neural stem cell,ANSCs)。AQP4對水分子具有雙向通透的特性,使其能夠在生理及病理狀態(tài)下快速調節(jié)細胞內(nèi)外水分子的重分布。在細胞毒性腦水腫中,AQP4可促進水分子進入星形膠質細胞,加劇腦水腫;在血管源性腦水腫中,AQP4可加速水腫液從腦實質向腦脊液與血管的外排,減輕腦水腫。星形膠質細胞是腦內(nèi)數(shù)量最多的細胞,參與細胞外離子緩沖、神經(jīng)遞質傳導、生長因子釋放以及神經(jīng)免疫調節(jié)。應用AQP4基因敲除鼠的研究顯示,AQP4不僅是腦內(nèi)一種特異性的水轉運孔道,而且調控星形膠質細胞功能,并廣泛參與腦內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持、神經(jīng)傳導等重要腦生理功能的調節(jié)。 成年神經(jīng)再生(adult neurogenesis)是當今神經(jīng)科學研究中最活躍、進展最快的領域之一。成年動物腦中側腦室下區(qū)(subventricular zone,SVZ)與海馬齒狀回顆粒細胞下區(qū)(subgranular zone,SGZ)存在ANSCs,參與腦中持續(xù)的神經(jīng)再生過程。ANSCs能自我更新、持續(xù)增殖并分化成神經(jīng)元、星形膠質細胞和少突膠質細胞。生理狀態(tài)下,神經(jīng)再生參與學習記憶、擇偶行為等多種腦高級功能的形成。在病理情況下,神經(jīng)再生能力的改變參與多種神經(jīng)精神疾病的發(fā)生及神經(jīng)修復過程。例如,抑郁癥患者SGZ神經(jīng)再生減弱,抗抑郁藥物可通過增強SGZ神經(jīng)再生產(chǎn)生治療學效應;增強腦卒中后神經(jīng)再生能顯著改善認知與運動功能缺損。但是,目前對于調節(jié)成年神經(jīng)再生過程的分子機制認識非常有限。因此,探索成年神經(jīng)再生的調節(jié)機制將為發(fā)展靶向于調制神經(jīng)再生的藥物提供新思路,為神經(jīng)干細胞移植治療積累學術基礎。 近年來的研究發(fā)現(xiàn),AQP4高度表達于SVZ、SGZ等神經(jīng)再生顯著的腦區(qū),并且在鼠、豬及人類神經(jīng)干細胞和神經(jīng)祖細胞均有AQP4的表達。然而,AQP4是否參與調節(jié)成年神經(jīng)再生?目前尚未見報道。因此,本文第一部分工作首先應用自行制備的AQP4基因敲除鼠在體研究AQP4基因敲除對SVZ/SGZ神經(jīng)干細胞增殖及SVZ結構發(fā)育的影響;第二部分工作應用離體培養(yǎng)的小鼠SVZ ANSCs,研究AQP4基因敲除對ANSCs自我更新、增殖、遷移、分化等生物學特性的影響及其調節(jié)機制;第三部分工作在建立慢性溫和應激(chronic mild stress,CMS)抑郁癥模型小鼠的基礎上,研究AQP4基因敲除對經(jīng)典抗抑郁藥物氟西汀(fluoxetine)促SGZ神經(jīng)再生作用的影響及其相關的分子機制。研究結果開拓了AQP4神經(jīng)生物學研究的新領域,深化對AQP4生理及病理功能的認識,揭示AQP4是調制成年神經(jīng)再生的重要靶點,為研發(fā)針對神經(jīng)修復的治療藥物提供新的靶標。 第一部分AQP4基因敲除對成年CD1小鼠SVZ/SGZ神經(jīng)干細胞增殖及SVZ結構發(fā)育的影響 目的:研究、闡明AQP4在成年小鼠SVZ/SGZ神經(jīng)干細胞增殖及SVZ結構發(fā)育中的作用。 方法:應用2月齡AQP4野生型(wildtype,AQP4~+/+)及AQP4基因敲除型(AQP4 knockout,AQP4-/-)雄性CD1小鼠,經(jīng)腹腔給予5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU,50mg/kg,每2小時一次,共4次)24小時后麻醉、灌注固定、取腦、冰凍切片,行BrdU免疫組化。取成年小鼠側腦室(lateral ventricle,LV)背外側區(qū)組織固定后行鋨酸染色,電鏡觀察SVZ細胞結構。應用出生后1、7、14、28、56日齡AQP4+/+及AQP4-/- CD1小鼠,斷頭取腦,石蠟包埋后切取側腦室前腳至中腦導水管出現(xiàn)部位冠狀切片,行HE染色及AQP4免疫組化,測定LV容積、計數(shù)SVZ細胞密度,分析SVZ AQP4表達的灰度值。取新鮮全腦組織,用干/濕比重法測定腦含水量。取2月齡小鼠,打開小腦延髓池,用濾紙(1 mm×5 mm)稱重法測定不同時間點腦脊液量。 結果:1)AQP4基因敲除顯著抑制成年小鼠SVZ神經(jīng)干細胞增殖,對SGZ神經(jīng)干細胞增殖無顯著影響。2)AQP4-/-小鼠側腦室容積顯著減小,室管膜層不連續(xù),部分區(qū)域室管膜細胞缺失,SVZ細胞數(shù)量顯著減少。3)電鏡示AQP4-/-小鼠室管膜細胞下層出現(xiàn)大量空泡樣結構。4)野生型小鼠SVZ AQP4表達在出生后發(fā)育過程中逐漸升高。5)出生1天的AQP4+/+與AQP4-/-小鼠腦含水量無統(tǒng)計學差異,自出生后7天起至出生后56天,AQP4-/-小鼠腦含水量顯著高于AQP4+/+小鼠。6)出生1天及7天的AQP4+/+與AQP4-/-小鼠LV容積、SVZ細胞密度無統(tǒng)計學差異;自出生后14天起至出生后56天,AQP4-/-小鼠LV容積、SVZ細胞密度則顯著低于AQP4+/+小鼠。7)AQP4基因敲除顯著減少成年小鼠腦脊液產(chǎn)量。 結論:AQP4基因敲除抑制成年小鼠SVZ神經(jīng)干細胞增殖,破壞SVZ細胞排列結構,并減少腦脊液產(chǎn)量、增加腦含水量,表明AQP4參與成年小鼠SVZ神經(jīng)干細胞增殖及SVZ結構形成的調控。 第二部分AQP4基因敲除對CD1小鼠SVZ成體神經(jīng)干細胞自我更新、增殖、遷移、分化的影響 目的:研究、闡明AQP4對離體培養(yǎng)的小鼠SVZ成體神經(jīng)干細胞自我更新、增殖、遷移、分化的影響及調控機制。 方法:分離培養(yǎng)2月齡AQP4+/+及AQP4-/-雄性小鼠SVZ ANSCs,應用神經(jīng)球分析法(neurosphere assay)測定兩種基因型ANSCs自我更新能力;采用BrdU摻入法測定ANSCs增殖能力;采用流式細胞儀法檢測ANSCs細胞周期。將神經(jīng)球貼壁生長48小時后測量ANSCs放射狀遷移距離。用1% FCS誘導ANSCs分化7天后,采用Tuj-(1neuron-specific class IIIβ-tubulin)與GFAP(glial fibrillary acidic protein)免疫熒光雙標法測定ANSCs向神經(jīng)元及星形膠質細胞表型分化的比率。將ANSCs負載鈣熒光探針Fluo 3-AM后采用激光共聚焦顯微鏡連續(xù)掃描,記錄細胞內(nèi)自發(fā)性鈣振蕩(spontaneous calcium oscillation)以及100 mM KCl所誘發(fā)的鈣瞬變(calcium transient)。應用RT-PCR及Western blotting法檢測神經(jīng)干細胞L型、T型電壓依賴性鈣通道及縫隙連接蛋白Connexin43(Cx43)的表達。 結果:1)AQP4-/- ANSCs形成原代、第二代、第三代神經(jīng)球的數(shù)量與大小以及BrdU標記陽性細胞比例均顯著少于AQP4+/+ ANSCs。2)流式細胞儀檢測結果顯示AQP4基因敲除使凋亡期細胞比例增加,并出現(xiàn)G2/M細胞周期阻滯。3)AQP4-/- ANSCs放射狀遷移距離顯著短于AQP4+/+ ANSCs。4)AQP4基因敲除使ANSCs分化成Tuj-1陽性(神經(jīng)元表型)細胞的比例顯著低于AQP4+/+ ANSCs,兩種基因型ANSCs分化成GFAP陽性(星形膠質細胞表型)細胞的比例無統(tǒng)計學差異。5)AQP4-/- ANSCs內(nèi)自發(fā)性鈣振蕩的振幅顯著低于AQP4+/+ ANSCs,頻率顯著快于AQP4+/+ ANSCs;AQP4-/- ANSCs經(jīng)高鉀誘導所產(chǎn)生鈣瞬變峰值顯著低于AQP4+/+ ANSCs。6)AQP4-/- ANSCs上L型電壓依賴性鈣通道Cav1.2及縫隙連接蛋白Cx43表達顯著低于AQP4+/+ ANSCs。 結論:AQP4基因敲除抑制離體ANSCs自我更新、增殖、遷移及向神經(jīng)元的分化,增強ANSCs自發(fā)性鈣振蕩的頻率、減弱鈣振蕩振幅,抑制去極化所致胞內(nèi)鈣瞬變,表明AQP4通過調控細胞內(nèi)鈣動力學影響ANSCs生物學特性。 第三部分AQP4基因敲除對氟西汀促成年CD1小鼠SGZ神經(jīng)再生作用的影響 目的:研究、闡明AQP4在氟西汀促SGZ神經(jīng)再生及其抗抑郁效應中的作用與機制。 方法:1)經(jīng)腹腔單次給予2-3月齡AQP4~+/+及AQP4~-/-雄性CD1小鼠氟西汀(10mg/kg),給藥后0.25、5、12小時,分別取小鼠血漿及海馬組織勻漿,用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)測定氟西汀及其代謝產(chǎn)物去氧氟西汀的含量;2)經(jīng)腹腔給予正常小鼠與慢性溫和應激(chronic mild stress,CMS)致抑郁癥模型小鼠氟西汀(10mg/kg),每日一次,持續(xù)四周。氟西汀給藥結束前三天,采用新奇抑制攝食實驗(novelty-suppressed feeding test,NSF)及懸尾實驗(tail suspension test,TST)測定氟西汀對正常小鼠的抗焦慮效應;采用糖水偏愛(sucrose preference)實驗及TST,評價氟西汀對抑郁癥模型小鼠的抗抑郁效應。3)腹腔注射BrdU(50mg/kg,每兩小時一次,共四次)24小時及28天后分批處死小鼠,灌注、取腦,行BrdU免疫組化/免疫熒光雙重標記,通過計數(shù)SGZ BrdU陽性細胞數(shù),NeuN/BrdU、GFAP/BrdU陽性細胞數(shù)測定海馬神經(jīng)干細胞增殖、存活及分化。4)取新鮮腦組織,勻漿后分別測定PKA、PKC活性,CREB、ERK1/2、CaMKⅣ磷酸化水平及AQP4表達水平。5)分離培養(yǎng)成年AQP4+/+及AQP4-/- CD1雄性小鼠海馬ANSCs,采用[3H]thymidine摻入法測定0.1、1μM氟西汀對海馬神經(jīng)干細胞增殖的影響。 結果:1)單次氟西汀給藥后0.25、5、12小時,兩種基因型小鼠血漿及海馬中氟西汀及去氧氟西汀的含量無統(tǒng)計學差異。2)AQP4基因敲除取消氟西汀的抗焦慮與抗抑郁作用。3)氟西汀能顯著促進正常AQP4+/+小鼠SGZ細胞增殖,而對正常AQP4-/-小鼠SGZ細胞增殖無顯著影響;氟西汀能逆轉CMS造模對AQP4+/+小鼠SGZ細胞增殖的抑制作用,而對CMS造模所致AQP4-/-小鼠SGZ細胞增殖抑制無顯著改善作用。4)AQP4基因敲除對BrdU標記陽性細胞存活的比例及其向神經(jīng)元與星形膠質細胞分化的比例無顯著影響。5)氟西汀能顯著增強正常AQP4~+/+小鼠海馬內(nèi)CREB及CaMKⅣ磷酸化,而對正常AQP4-/-小鼠海馬內(nèi)CREB及CaMKⅣ磷酸化水平無顯著影響;氟西汀對兩種基因型正常小鼠海馬ERK1/2磷酸化及PKA、PKC活性均無顯著影響。6)CMS造模能抑制兩種基因型小鼠海馬中CREB、CaMKⅣ、ERK1/2磷酸化,抑制PKA活性,對PKC活性無顯著影響;氟西汀能逆轉CMS所致兩種基因型小鼠海馬內(nèi)PKA活性及ERK1/2磷酸化水平的降低,對PKC活性無顯著影響;氟西汀能逆轉CMS造模所致AQP4+/+小鼠海馬CREB、CaMKⅣ磷酸化水平的下降,而對AQP4-/-小鼠CREB、CaMKⅣ磷酸化水平的下降無顯著改善作用。7)氟西汀能逆轉CMS造模所致海馬AQP4表達水平的升高。8)AQP4基因敲除顯著抑制離體培養(yǎng)的成年小鼠SGZ海馬神經(jīng)干細胞增殖,并取消0.1μM、1μM氟西汀促ANSCs增殖效應。 結論:AQP4基因敲除抑制慢性氟西汀給藥的促海馬神經(jīng)再生作用,進而取消氟西汀的抗抑郁效應,其機制可能與其抑制CaMKⅣ-CREB信號轉導通路相關;氟西汀可能是腦內(nèi)AQP4的調節(jié)劑。 綜上所述,本文研究工作的主要創(chuàng)新之處在于: 1.發(fā)現(xiàn)AQP4參與成年小鼠SVZ神經(jīng)干細胞增殖及SVZ結構形成的調控,為進一步研究腦內(nèi)AQP4的病理生理作用積累了學術基礎。 2.揭示AQP4是調節(jié)成年動物腦內(nèi)神經(jīng)再生的新靶點,為治療神經(jīng)再生障礙相關的神經(jīng)精神疾病提供了新的思路。 3.闡明AQP4通過調節(jié)CaMKⅣ-CREB信號轉導通路調制氟西汀促成年海馬SGZ神經(jīng)再生作用及抗抑郁效應。 4.發(fā)現(xiàn)氟西汀是腦內(nèi)AQP4的調節(jié)劑,拓展了對腦內(nèi)神經(jīng)再生的分子調控及氟西汀藥理作用機制的認識。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R329

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李偉;唐曉偉;林圣彬;周鴻銘;魯亞平;;雌激素受體α在抑郁癥模型大鼠海馬中的分布[J];安徽師范大學學報(自然科學版);2010年01期

2 闞紅衛(wèi),明亮,鄭麗芳,尹艷艷;BCPT對慢性應激抑郁大鼠行為及體重的影響[J];安徽衛(wèi)生職業(yè)技術學院學報;2005年02期

3 周志華;韓詠竹;;抑郁癥動物模型的研究進展[J];安徽醫(yī)學;2008年02期

4 周蘭蘭,明亮,馬傳庚,程燕,江勤;新型蟲生菌提取物對慢性應激抑郁大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌的影響[J];安徽醫(yī)藥;2005年06期

5 鄭麗芳,明亮;抑郁癥動物模型的研究與應用[J];安徽醫(yī)藥;2005年11期

6 張有志,聶惠民,張德昌;柴地合方對慢性應激大鼠大腦前額皮質和海馬單胺類神經(jīng)遞質的影響[J];安徽中醫(yī)學院學報;2005年01期

7 秦麗娜;史榕荇;圖婭;;電針對慢性應激抑郁模型大鼠腦腸肽類激素的影響[J];安徽中醫(yī)學院學報;2007年01期

8 崔冬雪;范秦海;劉建國;季瀏;;游泳運動對實驗性抑郁癥大鼠行為學指標及皮質酮含量的影響[J];北京體育大學學報;2007年01期

9 周海虹;陸lN;陳艷玲;朱紅梅;王訓;胡紀原;韓詠竹;;柴郁溫膽湯對大鼠抑郁模型行為學及腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質的影響[J];中華中醫(yī)藥雜志;2008年10期

10 徐舒;陳合兵;李洪;張琪;蔡紅兵;顏賢忠;呂志平;;“肝郁證”大鼠模型的建立及代謝組學的初步研究[J];中華中醫(yī)藥雜志;2009年06期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 蘇芬麗;高維;涂繼瑩;李煥德;;文拉法辛在抑郁癥模型大鼠體內(nèi)生化機制的代謝物組學研究[A];2010年廣東省藥師周大會論文集[C];2011年

2 王彥云;鄭軍;李多嬌;潘菊華;黃世敬;;開心解郁湯對血管性抑郁大鼠模型的行為及體重的影響[A];2009年中國藥學大會暨第九屆中國藥師周論文集[C];2009年

3 王彥云;鄭軍;李多嬌;潘菊華;黃世敬;;開心解郁湯對血管性抑郁大鼠模型的行為及體重的影響[A];2010年中國藥學大會暨第十屆中國藥師周論文集[C];2010年

4 黃世敬;王彥云;鄭軍;李多嬌;潘菊華;;開心解郁方對血管性抑郁大鼠模型的行為學干預研究[A];2009年全國中藥學術研討會論文集[C];2009年

5 張春虎;胡隨瑜;王素娥;邱娟;李云輝;;柴胡疏肝散及其拆方對慢性應激抑郁模型大鼠海馬組織ERK1/2mRNA表達的影響[A];中國中西醫(yī)結合學會精神疾病專業(yè)委員會第十屆學術會議論文集[C];2010年

6 徐世芬;莊禮興;唐純志;楊君軍;;針刺與埋線干預對抑郁模型大鼠中樞單胺類神經(jīng)遞質的影響[A];廣東省針灸學會第十次學術交流會論文匯編[C];2007年

7 陳華德;金靈青;婁冉;;電針百會穴對慢性應激抑郁模型大鼠行為學的影響[A];中國針灸學會2009學術年會論文集（上集）[C];2009年

8 徐治;李娜;趙興蓉;許秀峰;;長期應激對大鼠行為學和神經(jīng)內(nèi)分泌免疫的影響[A];中華醫(yī)學會首屆國際行為醫(yī)學學術大會暨第九次全國行為醫(yī)學學術會議論文匯編[C];2007年

9 羅斌;唐啟盛;司銀楚;侯秀娟;徐向青;;腦出血后抑郁模型大鼠腦內(nèi)單胺神經(jīng)遞質的表達的改變[A];2005全國中醫(yī)腦病學術研討會論文匯編[C];2005年

10 趙建軍;王健;;針刺對腦卒中后抑郁大鼠體重及行為學影響的研究[A];2005全國中醫(yī)腦病學術研討會論文匯編[C];2005年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王曉濱;坤寧安對圍絕經(jīng)期慢性應激抑郁大鼠行為的影響及作用機制研究[D];黑龍江中醫(yī)藥大學;2010年

2 楊甲芳;青藏高原三種小哺乳動物CRFR1α的研究[D];浙江大學;2011年

3 鄭興東;CRH、ACTH、NPY和GAL在抑郁癥發(fā)病中作用及其機制的研究[D];第二軍醫(yī)大學;2001年

4 韓毳;電針治療抑郁癥的臨床與實驗研究[D];北京中醫(yī)藥大學;2002年

5 趙虎;天敵應激對大鼠海馬神經(jīng)元的損害作用及海馬類固醇激素受體系統(tǒng)對精神應激反應的調節(jié)效應研究[D];汕頭大學;2003年

6 周蘭蘭;一種白僵菌代謝產(chǎn)物提取物（BCEF0083）抗實驗性抑郁的作用及機制研究[D];安徽醫(yī)科大學;2003年

7 呂梅;針刺結合SSRI_s類藥物治療抑郁癥的研究[D];南京中醫(yī)藥大學;2004年

8 賈寶輝;電針對慢性應激模型大鼠下丘腦—垂體—腎上腺（HPA）軸調節(jié)作用的機理研究[D];北京中醫(yī)藥大學;2005年

9 李文迅;電針對抑郁模型大鼠行為學、海馬形態(tài)結構和海馬nNOS mRNA及BDNF蛋白表達的影響[D];北京中醫(yī)藥大學;2005年

10 侯秀娟;從單胺遞質及其受體探討頤腦解郁方對腦卒中后抑郁干預機理的研究[D];北京中醫(yī)藥大學;2005年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 黃一鳴;水通道蛋白3在表皮生長因子誘導人胃腺癌細胞增殖、遷移中的作用[D];南京醫(yī)科大學;2010年

2 劉偉;厄貝沙坦預處理對缺血再灌注大鼠血腦屏障的影響及機制研究[D];南京醫(yī)科大學;2010年

3 桑倩;慢性應激對大鼠空間學習記憶影響機制的研究[D];浙江理工大學;2010年

4 李慧;肝郁血瘀型宮環(huán)出血病病癥結合大鼠模型的建立及研究[D];湖南中醫(yī)藥大學;2010年

5 劉恒煉;身心應激誘導大鼠卵巢早衰模型的建立及機制研究[D];華中科技大學;2010年

6 江波;三七皂苷Rg1的抗抑郁作用及其機制[D];華中科技大學;2009年

7 南睿;慢性應激肝郁證大鼠模型的建立及其形成機制的初步研究[D];北京中醫(yī)藥大學;2002年

8 邱艷明;電針對抑郁模型大鼠單胺類神經(jīng)遞質影響的實驗研究[D];北京中醫(yī)藥大學;2002年

9 楊石;卒中后抑郁大鼠模型的建立及郁樂疏治療卒中后抑郁的實驗研究[D];成都中醫(yī)藥大學;2003年

10 陳巧珍;慢性應激對大鼠腦內(nèi)NMDAR1蛋白表達及NO含量的影響[D];浙江大學;2004年

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本文編號：2209276