【摘要】：NSPc1是在神經(jīng)系統(tǒng)高表達(dá)的Polycomb家族成員,與干細(xì)胞維持因子Bmi1高度同源oNSPc1可以使小鼠胚胎干細(xì)胞一定程度上不依賴白血病抑制因子(Leukemic Inhibitory Factor, LIF)進(jìn)行自我更新；我們的前期研究發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄抑制作用,并在多種終末分化神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于神經(jīng)干細(xì)胞,敲低NSPc1可使P19和NT2等神經(jīng)分化模型細(xì)胞增殖能力下降,分化趨勢(shì)加強(qiáng)。因此人們預(yù)測(cè)NSPc1也在干細(xì)胞維持中起作用,尤其在神經(jīng)干細(xì)胞中功能更重要。但目前尚沒有足夠的研究闡釋NSPc1在神經(jīng)分化過程中所調(diào)控的靶基因信息。 在本實(shí)驗(yàn)中,我們首先建立了P19細(xì)胞在1μM維甲酸誘導(dǎo)下向神經(jīng)元分化的模型,這是一個(gè)離體研究神經(jīng)干細(xì)胞分化過程的成熟模型。采用Western Blot檢測(cè)了NSPc1在該模型中表達(dá)水平的變化；結(jié)果顯示NSPc1蛋白的表達(dá)水平在P19細(xì)胞神經(jīng)分化模型第6天(相當(dāng)于神經(jīng)元)明顯低于第0天(相當(dāng)于未分化干細(xì)胞)。 接下來,采用染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)合基因芯片分析(ChIP-on-chip)技術(shù)篩查了NSPc1在P19細(xì)胞中的靶基因譜,并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分類。篩選出的1280個(gè)NSPc1靶基因,在“細(xì)胞、代謝、發(fā)育”等生物過程中富集,集中于“結(jié)合(Binding)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)”兩個(gè)分子功能群,且多定位于“細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞器”內(nèi)；并且許多與“分化、發(fā)育、轉(zhuǎn)錄及其調(diào)節(jié)、神經(jīng)發(fā)生”相關(guān)的基因功能術(shù)語(yǔ)(Gene Ontology Terms),在NSPc1靶基因歸類中出現(xiàn)的頻率顯著高于其基因組頻率。 最后,綜合考慮了芯片結(jié)果、既往表達(dá)譜芯片結(jié)果和基因功能相關(guān)文獻(xiàn)后,我們選擇了靶基因群中的7個(gè)預(yù)測(cè)靶基因進(jìn)行功能驗(yàn)證,用Real-time PCR檢測(cè)NSPc1以及這些靶基因在P19細(xì)胞神經(jīng)分化模型中表達(dá)水平的變化。這7個(gè)靶基因分別為：Cdk9, Hmgb2, Hnrnpl, Rgmb, Rnf10, Tnk2和Zfp148。結(jié)果顯示,NSPc1的mRNA水平在P19細(xì)胞神經(jīng)分化過程中,第6天時(shí)降低,第10天又回升,即在“神經(jīng)干細(xì)胞—神經(jīng)前體細(xì)胞—不成熟神經(jīng)元”的過程里NSPc1表達(dá)下降,但在神經(jīng)元成熟過程中又再次升高。在7個(gè)預(yù)測(cè)靶基因中：Cdk9和Tnk2在第6天明顯降低,Hnrnp1和Rnf10在第6天則明顯升高。 可見,在P19細(xì)胞神經(jīng)分化模型中,NSPc1本身的表達(dá)是動(dòng)態(tài)變化的；隨之也動(dòng)態(tài)地調(diào)控著大量參與神經(jīng)細(xì)胞增殖、分化與成熟等過程的靶基因；從NSPc1與選擇驗(yàn)證的若干靶基因的相對(duì)表達(dá)變化看,調(diào)控機(jī)制很可能是復(fù)雜的,多層次的和網(wǎng)絡(luò)化的。
[Abstract]:NSPc1 is a member of the Polycomb family with high expression in the nervous system. ONSPc1, which is highly homologous to stem cell maintenance factor Bmi1, can make mouse embryonic stem cells independent of leukemia inhibitory factor (LIF) for self-renewal to a certain extent; our previous studies found that NSPc1 has strong transcriptional inhibition, and The expression of NSPc1 in a variety of terminal differentiated neurons is much lower than that in neural stem cells. Knocking down NSPc1 can decrease the proliferation of P19 and NT2 neuronal differentiation model cells and enhance the differentiation trend. Objective to clarify the target gene information regulated by NSPc1 during neural differentiation.
In this experiment, we first established a neuronal differentiation model of P19 cells induced by 1 mu retinoic acid, which is a mature model for studying the differentiation process of neural stem cells in vitro. Model sixth days (equivalent to neurons) were significantly lower than zeroth days (equivalent to undifferentiated stem cells).
Next, the target gene profiles of NSPc1 in P19 cells were screened by chromatin immunoprecipitation combined with gene chip analysis (ChIP-on-chip) and bioinformatics classifications were carried out. "Two functional groups of molecules, most of which are located in"cell structure, organelles"; and many Gene Ontology Terms related to"differentiation, development, transcription and regulation, neurogenesis"appear more frequently in the classification of NSPc1 target genes than in their genomic frequencies.
Finally, considering the results of the microarray, the results of the previous microarray and the literature related to gene function, we selected seven predictive target genes from the target gene group for functional verification. Real-time PCR was used to detect the expression level of NSPc1 and these target genes in P19 cell neural differentiation model. Hmgb2, Hnrnpl, Rgmb, Rnf10, Tnk2 and Zfp148. The results showed that the mRNA level of NSPc1 decreased on day 6 and increased again on day 10 during the neural differentiation of P19 cells, that is, the expression of NSPc1 decreased during the process of "neural stem cells-neural precursor cells-immature neurons", but increased again during the maturation of neurons. Target genes: Cdk9 and Tnk2 decreased significantly on the sixth day, while Hnrnp1 and Rnf10 increased significantly in sixth days.
It can be seen that the expression of NSPc1 itself is dynamic in the neural differentiation model of P19 cells; it also dynamically regulates a large number of target genes involved in the process of neural cell proliferation, differentiation and maturation; from the relative expression changes of NSPc1 and several target genes verified by selection, the regulatory mechanism is likely to be complex, multi-level and network. Collaterals.
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R329.2

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本文編號(hào)：2202521