【摘要】： 前言 胚胎干細胞(Embryonic stem cells,ESCs)來自囊胚內(nèi)細胞團(Inner cell mass,ICM),在體外可長期自我復(fù)制,并且具有分化成內(nèi)、中、外三個胚層細胞的多潛能性,研究表明其可在體外分化為神經(jīng)細胞。而神經(jīng)細胞被認為是終末分化細胞,其損傷后很難再由自體的神經(jīng)干細胞補充,研究ESCs向神經(jīng)細胞的分化不僅可以作為研究哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的體外模型,了解神經(jīng)分化過程中基因表達調(diào)控的變化機制;還可以應(yīng)用于臨床,為神經(jīng)系統(tǒng)疾病,如帕金森癥、腦卒中、癲癇,及脊髓損傷等患者進行細胞移植,使其盡快康復(fù)。但是,目前人們對胚胎干細胞向神經(jīng)細胞分化的確切機制仍不夠了解。 本課題組前期已建立了將小鼠胚胎干細胞定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細胞的“序貫誘導(dǎo)法”,本研究在優(yōu)化“序貫誘導(dǎo)法”誘導(dǎo)條件的基礎(chǔ)上,通過應(yīng)用免疫熒光法和蛋白質(zhì)免疫印記法對分化后細胞進行神經(jīng)細胞標志物鑒定,并用流式細胞儀測定分化比率,為進一步研究胚胎干細胞向神經(jīng)細胞分化的作用機理打下基礎(chǔ),以期揭示出胚胎干細胞分化的確切機制。 方法 1、飼養(yǎng)層細胞制備、ESCs培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 使用原代小鼠胚胎成纖維細胞(PMEF)第2-4代狀態(tài)好的作為飼養(yǎng)層細胞,mESCs(小鼠ES細胞系A(chǔ)B2.1,由美國南加州大學醫(yī)學院惠贈)接種培養(yǎng)于其上。誘導(dǎo)分化時去飼養(yǎng)層,重新接種于無包被的培養(yǎng)皿中,使用NSC培養(yǎng)液,逐漸更換為無血清NC培養(yǎng)液。 2、“序貫誘導(dǎo)法”分化條件的優(yōu)化 (1)誘導(dǎo)分化時ESCs接種的密度梯度 (2)首次換用NSC培養(yǎng)液時培養(yǎng)液的濃度梯度 (3)逐漸更換為無血清NC培養(yǎng)液的時間梯度 3、鑒定誘導(dǎo)分化后細胞的特異性標志物 (1)免疫熒光法檢測神經(jīng)干細胞及成熟神經(jīng)細胞特異性抗原Nestin、NeuN、TUJ1、NCAM1和GFAP (2)蛋白質(zhì)免疫印記法(Western Blotting)檢測成熟神經(jīng)元特異性標志物TUJ1 4、流式細胞儀測定NeuN陽性細胞百分比,計算誘導(dǎo)分化比率。 實驗結(jié)果 1、優(yōu)化了“序貫誘導(dǎo)法”的誘導(dǎo)條件 優(yōu)化后“序貫誘導(dǎo)法”在分化時首次接種所用培養(yǎng)液的血清濃度為12.5%,mESCs最佳接種密度為1.0×10~5/ML,完全使用無血清NC培養(yǎng)液的時間應(yīng)為誘導(dǎo)第5天。 2、使用優(yōu)化的“序貫誘導(dǎo)法”,可簡便、高效、穩(wěn)定的將ESCs誘導(dǎo)為神經(jīng)元樣細胞 未分化的ESCs聚集成團狀生長,細胞排列緊密,集落邊界清楚。使用優(yōu)化的“序貫誘導(dǎo)法”可將ESCs大比例誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細胞,光鏡下觀察細胞形態(tài)均一,胞體圓亮,突起細長。 3、鑒定分化后細胞的神經(jīng)細胞特異性抗原 免疫熒光法檢測神經(jīng)干細胞及成熟神經(jīng)元特異性抗原Nestin、NSE、NeuN、TUJ1和NCAM1表達陽性,神經(jīng)膠質(zhì)細胞標志物GFAP表達陰性;蛋白質(zhì)免疫印記法檢測到成熟神經(jīng)細胞特異性標志物TUJ1表達陽性。 4、流式細胞儀檢測NeuN陽性細胞百分比,計算出誘導(dǎo)分化比率為89.91%±2.03%。 結(jié)論 根據(jù)本研究所得的實驗結(jié)果,可得出以下結(jié)論: 1、優(yōu)化的“序貫誘導(dǎo)法”可穩(wěn)定誘導(dǎo)ESCs高比率分化神經(jīng)元樣細胞,并經(jīng)過鑒定具有了成熟神經(jīng)元特異性標志物,而可能正是這些標志物基因的程序性表達,與定向分化的機制相關(guān)。 2、應(yīng)用流式細胞儀將分化結(jié)果作了定量分析,明確得出誘導(dǎo)分化比率可達89.91%±2.03%。
[Abstract]:Preface
Embryonic stem cells (ESCs) are derived from the intrablastocyst mass (ICM) and can reproduce themselves for a long time in vitro, and have the multipotential to differentiate into three embryonic layers: inner, middle and outer. Studies have shown that ESCs can differentiate into nerve cells in vitro. Neural cells are considered terminal differentiated cells and are difficult to differentiate after injury. The study of ESCs differentiation into neural cells supplemented by autologous neural stem cells can not only be used as an in vitro model for studying the development of mammalian nervous system to understand the mechanism of gene expression regulation during neural differentiation, but also be used in clinic for nervous system diseases such as Parkinson's disease, stroke, epilepsy, and spinal cord injury. However, the exact mechanism by which embryonic stem cells differentiate into neural cells is still poorly understood.
Our research group has established a sequential induction method to induce mouse embryonic stem cells to differentiate into neuron-like cells. On the basis of optimizing the induction conditions of the sequential induction method, the differentiated cells were identified by immunofluorescence and protein immunoblotting, and then the neuronal markers were identified by flow cytometry. The differentiation ratio was measured by a cell analyzer, which laid a foundation for further study on the mechanism of embryonic stem cell differentiation into neural cells, in order to reveal the exact mechanism of embryonic stem cell differentiation.
Method
1, feeder layer cell preparation, ESCs culture and induced differentiation.
The second to fourth passages of primary mouse embryonic fibroblasts (PMEF) were used as feeder layer cells, and mESCs (mouse ES cell line AB2.1, a gift from USC Medical College) were inoculated and cultured on them. Liquid.
2, the optimization of differentiation conditions by sequential induction method.
(1) density gradient of ESCs inoculation when inducing differentiation.
(2) the concentration gradient of culture medium for the first time when NSC culture medium was replaced.
(3) the time gradient of gradually replacing serum free NC medium.
3, identify specific markers of differentiated cells.
(1) Nestin, NeuN, TUJ1, NCAM 1 and GFAP were detected by immunofluorescence assay.
(2) protein immunoblotting (Western Blotting) was used to detect mature neuron specific marker TUJ1.
4, the percentage of NeuN positive cells was measured by flow cytometry, and the ratio of induced differentiation was calculated.
experimental result
1, optimize the induction condition of sequential induction method.
The optimum concentration of serum and the optimum density of mESCs were 12.5% and 1.0 65507
2, the optimized sequential induction method can be used to induce ESCs into neuron like cells in a simple, efficient and stable manner.
The undifferentiated ESCs grew in clumps with compact cell arrangement and clear colony boundary. ESCs could be induced to differentiate into neuron-like cells in large proportion by the optimized sequential induction method. The morphology of the cells was uniform, the soma was round and the processes were slender under light microscope.
3, identify the neural cell specific antigen of differentiated cells.
Nestin, NSE, NeuN, TUJ1 and NCAM1 were positive by immunofluorescence assay, but GFAP was negative by immunoblotting, and TUJ1 was positive by immunoblotting.
4, the percentage of NeuN positive cells was detected by flow cytometry, and the induced differentiation rate was 89.91% + 2.03%..
conclusion
Based on the experimental results obtained in this study, the following conclusions can be drawn:
1. The optimized sequential induction method can stably induce ESCs to differentiate into neuron-like cells at high rates, and has identified specific markers of mature neurons, which may be the procedural expression of these markers genes and may be related to the mechanism of directional differentiation.
2. The results of differentiation were analyzed quantitatively by flow cytometry. The induction rate was 89.91%+2.03%.
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R329

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本文編號：2202243