【摘要】： NKG2D是一種激活性受體,由同源二聚體構(gòu)成,可表達于NK細胞、NKT細胞、CD8+αβT細胞和γδT細胞等多種免疫細胞表面,在固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中都起著非常重要的作用。近年來,UL16結(jié)合蛋白(ULBPs)作為一類新發(fā)現(xiàn)的人NKG2D配體家族日益受到關(guān)注。MULT1及其的剪切變體MULT1S,是ULBPs在小鼠的同類物,是小鼠的NKG2D配體。MULT1在正常的細胞膜上不表達或表達水平很低。在病理條件下,如在應(yīng)激細胞、細菌或病毒感染細胞和腫瘤細胞,MULT1表達可上調(diào),并通過與小鼠NKG2D受體結(jié)合,介導(dǎo)抗感染和腫瘤免疫。 MULT1/MULT1S是跨膜蛋白,其胞內(nèi)段較長,除了通過NKG2D受體介導(dǎo)抗感染和腫瘤免疫外,是否還具有其它功能,如是否與胸腺的發(fā)育有關(guān),是否有反向的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能以及抗原提呈細胞上是否會表達MULT1/MULT1S作為危險信號或作為協(xié)同刺激分子發(fā)揮作用,MULT1和MULT1S兩者在功能上有何區(qū)別等問題,目前文獻尚無報道,有必要進一步的研究。因此,我們建立了MULT1/MULT1S的轉(zhuǎn)基因小鼠模型,旨在通過過表達MULT1/MULT1S,比較兩種轉(zhuǎn)基因小鼠MULT1/MULT1S在組織中的表達及其對免疫系統(tǒng)的影響,以了解它們的免疫學(xué)功能。 本論文的第一部分主要是將構(gòu)建的兩個品系的轉(zhuǎn)基因小鼠MULT1Tg (3'S和4'S)及3個品系的MULT1STg (7'S、10'S和41’S)與野生型C57BL／6小鼠交配,以產(chǎn)生Fl代小鼠,并對F1代小鼠進行基因型和表型的鑒定,為篩選符合進一步研究需要的轉(zhuǎn)基因小鼠提供依據(jù)。通過提取F1代轉(zhuǎn)基因小鼠的基因組DNA進行基因組PCR及Southern blotting,以鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型。結(jié)果獲得鑒定陽性的小鼠3’S 25只、4'S 13只、7'S 16只、10'S 42只和41’S 9只。對小鼠尾部組織和尾血mRNA的實時定量RT-PCR檢測結(jié)果表明,3’S和4'S品系的MULT1Tg小鼠以及10’S和41’S品系的MULT1STg小鼠的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物陽性,可用于進行下一步研究。應(yīng)用流式細胞分析以及免疫組化對MULT1Tg小鼠多種組織細胞進行初步分析的結(jié)果顯示,MULT1主要表達在胸腺和小腸上皮間淋巴細胞,在脾細胞上基本不表達,且在小腸上皮間淋巴細胞表面的表達與小鼠的年齡有關(guān)。這提示下一步研究應(yīng)主要開展胸腺、腸道及皮膚組織的相關(guān)研究。 本文的第二部分是有關(guān)人γδT細胞對類脂A的識別機制的研究(此部分與崔永春博士共同完成)。首先,應(yīng)用流式細胞術(shù)、3H-TdR摻入實驗和羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, CFSE)染色方法分別檢測了在加與不加單核細胞來源的樹突狀細胞(monocyte-derived dendritic cell, moDC)的條件下,類脂A誘導(dǎo)人外周血來源的γδT細胞的增殖情況。結(jié)果顯示,當(dāng)moDC存在時,LA能誘導(dǎo)人類γδT細胞明顯增殖,而無moDC存在時,基本上觀察不到γδT細胞有增殖現(xiàn)象。這提示γδT細胞僅識別由moDC遞呈的LA抗原。其次,抗CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、TCRγδ、LA、MHCI和MHCⅡ抗體對LA誘導(dǎo)的γδT細胞增殖的阻斷實驗結(jié)果表明,只有抗CD1b、CD1c、TCRγδ和LA的抗體能明顯阻斷LA誘導(dǎo)的γδT細胞增殖,而其它抗體沒有此阻斷效應(yīng)；提示γδT細胞對LA的識別,是由moDC細胞提呈,由moDC細胞上的CD1b和CD1c分子介導(dǎo),并依賴于TCRγδ的過程。最后,對LA反應(yīng)性γδT細胞的TCRγδCDR3區(qū)基因序列的測定結(jié)果,未見有特異性保守序列,但發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢取用J1片段,尚需對其結(jié)合特性作進一步驗證。上述發(fā)現(xiàn)豐富了對γδT細胞識別脂類抗原機制的認識。
[Abstract]:NKG2D is an active receptor, which is composed of homologous dimers and can be expressed on the surface of NK cells, NKT cells, CD8 + alpha beta T cells and gamma delta T cells. It plays an important role in innate and adaptive immune responses. In recent years, UL16 binding proteins (ULBPs) have become a new class of human NKG2D ligand family. MuLT1 and its shear variant MULT1S, the analogue of ULBPs in mice and the NKG2D ligand in mice, are not expressed or expressed at very low levels on normal cell membranes. Anti infection and tumor immunity.
MULT1/MULT1S is a transmembrane protein with a long intracellular segment. It has other functions besides anti-infection and tumor immunity mediated by NKG2D receptor, such as whether it is related to the development of thymus, whether it has the function of reverse signal transduction and whether MULT1/MULT1S is expressed as a dangerous signal or as a co-stimulus on antigen presenting cells. There is no report on the functional differences between MULT1 and MULT1S, so it is necessary to study them further. Therefore, we have established a transgenic mouse model of MULT1/MULT1S to compare the expression of MULT1/MULT1S in tissues and its immune system by overexpressing MULT1/MULT1S. The influence of the system is to understand their immunological functions.
In the first part of this paper, two murine strains MULT1Tg (3'S and 4'S) and three mutant strains MULTT1STg (7'S, 10'S and 41'S) were mated with wild type C57BL/6 mice to produce Fl mice. Genotype and phenotype of F1 mice were identified to screen transgenic mice for further study. The genomic DNA of F1 transgenic mice was extracted for genomic PCR and Southern blotting to identify the genotype of transgenic mice. Results The positive mice were identified as 3'S 25, 4'S 13, 7'S 16, 10'S 42 and 41'S 9. The results of real-time quantitative RT-PCR showed that the mRNA of tail tissue and tail blood of mice were positive. The results of flow cytometry and immunohistochemistry showed that MULT1 was mainly expressed in thymus and small intestinal epithelial lymph nodes. The expression of lymphocytes on the surface of intestinal epithelial lymphocytes is related to the age of mice, which suggests that the next step of research should mainly focus on thymus, intestine and skin tissue.
The second part of this paper is about the recognition mechanism of lipid A by human gamma delta T cells (this part was completed with Dr. Cui Yongchun). Firstly, flow cytometry, 3H-TdR incorporation assay and carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) staining were used to detect the lipid A. Lipid A could induce the proliferation of human peripheral blood-derived gamma delta T cells with or without monocyte-derived dendritic cells (moDC). The results showed that LA could induce the proliferation of human gamma delta T cells in the presence of moDC, but the proliferation of human gamma delta T cells could not be observed in the absence of moDC. These results suggest that gamma delta T cells recognize only LA antigens presented by moDC. Secondly, anti-CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, TCR gamma delta, LA, MHCI and MHCII antibodies can block the proliferation of LA-induced gamma delta T cells. The results show that only anti-CD1b, CD1c, TCR gamma delta and LA antibodies can significantly block the proliferation of LA-induced gamma delta T cells. These results suggest that the recognition of LA by gamma delta T cells is mediated by CD1b and CD1c molecules on moDC cells and depends on the process of TCR gamma delta. Finally, the sequencing of TCR gamma delta CDR3 region gene in LA reactive gamma delta T cells showed no specific conservative sequence, but the J1 fragment was found to be the dominant candidate for LA binding. The above findings enrich the understanding of the mechanism of the recognition of lipid antigens by gamma delta T cells.
【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392

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本文編號：2192182