發(fā)布時(shí)間：2018-08-19 08:59

【摘要】：大量實(shí)驗(yàn)證明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)能抑制T細(xì)胞的增殖、應(yīng)答,而且在異基因造血干細(xì)胞聯(lián)合MSC移植治療惡性血液病的實(shí)踐中,MSC促進(jìn)移植物的植入,促進(jìn)受體造血恢復(fù),抑制移植物抗宿主病(GVHD)的發(fā)生,降低GVHD的發(fā)生率和嚴(yán)重程度。目前,有關(guān)MSCs調(diào)節(jié)免疫方面的報(bào)道很多,尤其是MSCs對(duì)淋巴細(xì)胞抑制效應(yīng)的研究,但是MSCs免疫抑制的機(jī)制仍不清楚。有實(shí)驗(yàn)報(bào)道小鼠MSC通過產(chǎn)生一氧化氮(nitrooxide,NO)介導(dǎo)其對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的抑制作用,NO抑制T細(xì)胞增殖可能是通過影響了JaK3/STAT5信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中STAT5酪氨酸蛋白激酶的磷酸化而實(shí)現(xiàn)的。而在異基因淋巴細(xì)胞作為刺激因素的混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)(Mixedlymphocyte reaction,MLR)中,NO是否在人MSCs(hMSCs)抑制外周血淋巴細(xì)胞增殖的過程中發(fā)揮作用呢?基于此,我們分離培養(yǎng)hMSCs,建立以異基因淋巴細(xì)胞作為刺激因素的MLR,探討反應(yīng)體系中NO的產(chǎn)生,及其在hMSC對(duì)淋巴細(xì)胞增殖、凋亡和淋巴細(xì)胞FOXP3 mRNA表達(dá)的影響中的作用。 無菌抽取健康志愿者骨髓,制備骨髓細(xì)胞懸液,采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞,傳代培養(yǎng)至P4/P5消化后應(yīng)用。分別以外周血T淋巴細(xì)胞為反應(yīng)細(xì)胞,絲裂霉素C滅活的異基因淋巴細(xì)胞為刺激細(xì)胞建立混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系(MLR)。MSC/MLR共培養(yǎng)體系中MSC與反應(yīng)T淋巴細(xì)胞數(shù)量比為1:10,在有或無誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)抑制劑(L-NAME)存在下,以CCK-8法檢測(cè)T淋巴細(xì)胞增殖,Giess法檢測(cè)各MLR體系上清中NO含量,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各MLR體系中淋巴細(xì)胞凋亡比例,Real-time PCR監(jiān)測(cè)各MLR體系中FOXP3mRNA表達(dá)水平。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,1 hMSC對(duì)淋巴細(xì)胞反應(yīng)性增殖具有抑制作用,表示淋巴細(xì)胞增殖活性的OD值為0.49±0.03,加入L-NAME后,共培養(yǎng)體系中NO產(chǎn)生減少同時(shí)淋巴細(xì)胞的增殖有所恢復(fù),OD值為0.92±0.03。2 hMSC干預(yù)下,共培養(yǎng)體系中淋巴細(xì)胞凋亡比例為(20.83±1.69)%。加入L-NAME后,反應(yīng)體系中的淋巴細(xì)胞凋亡比例為(9.56±0.96)%,與hMSC干預(yù)組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。3hMSC干預(yù)下,共培養(yǎng)體系中淋巴細(xì)胞Foxp3 mRNA的表達(dá)水平升高,為(1.56±0.34)%,與對(duì)照組(0.74±0.15)%相比,有顯著性差異(P＜0.05),加入L-NAME后,Foxp3 mRNA的表達(dá)水平為(0.81±0.18)%。 通過實(shí)驗(yàn)我們得出以下結(jié)論,NO在hMSC抑制異基因抗原誘發(fā)的淋巴細(xì)胞增殖中起重要作用,其機(jī)制可能是通過促進(jìn)凋亡、影響FOXP3的表達(dá)進(jìn)而影響調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能。
[Abstract]:A large number of experiments have proved that bone marrow mesenchymal stem cells (Mesenchymal Stem) can inhibit the proliferation and response of T cells. Moreover, in the practice of allogeneic hematopoietic stem cells combined with MSC transplantation in the treatment of malignant hematological diseases, bone marrow mesenchymal stem cells can promote graft implantation and promote hematopoietic recovery. To inhibit the occurrence of graft-versus host disease (GVHD) and to reduce the incidence and severity of GVHD. At present, there are many reports about MSCs regulating immunity, especially the effect of MSCs on lymphocyte inhibition, but the mechanism of MSCs immunosuppression is still unclear. It has been reported that mouse MSC inhibits T cell proliferation by producing nitric oxide (no) mediated by nitric oxide (no). The inhibition of T cell proliferation by no may be achieved by affecting the phosphorylation of STAT5 tyrosine protein kinase in JaK3/STAT5 signal transduction pathway. And does no play a role in the Mixedlymphocyte reaction of Mixedlymphocyte reactionation in which allogeneic lymphocytes act as stimulus factors in the process of inhibiting the proliferation of peripheral blood lymphocytes by human MSCs (hMSCs)? Based on this, we isolated and cultured hMSCs and established MLRs with allogeneic lymphocytes as stimulus factors to investigate the production of no in the reaction system and its role in the effects of hMSC on lymphocyte proliferation, apoptosis and lymphocyte FOXP3 mRNA expression. Bone marrow suspension was prepared from healthy volunteers by sterile extraction. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells were isolated by whole bone marrow adherent culture method. The MSCs were subcultured after P4/P5 digestion. Peripheral blood T lymphocytes were used as reaction cells, Mitomycin C inactivated allogeneic lymphocytes were used as stimulators to establish a mixed lymphocyte culture system (MLR). MSC-MLR) in which the ratio of MSC to reactive T lymphocytes was 1: 10. In the presence or absence of inducible nitric oxide synthase (iNOS) inhibitor (L-NAME), the ratio of MSC to reactive T lymphocytes was 1: 10. The content of no in supernatant of MLR system was detected by CCK-8 method, and the expression of FOXP3mRNA in MLR system was detected by real-time PCR and flow cytometry. The results showed that 1 hMSC could inhibit the reactive proliferation of lymphocytes, and the OD value of lymphocyte proliferation activity was 0.49 鹵0.03. After the addition of L-NAME, the OD value was 0.49 鹵0.03. The ratio of apoptosis in co-culture system was (20.83 鹵1.69) under the intervention of 0.92 鹵0.03.2 hMSC. After the addition of L-NAME, the percentage of lymphocyte apoptosis was (9.56 鹵0.96) in the reaction system. Compared with the hMSC intervention group, the expression of Foxp3 mRNA in the co-cultured system was significantly higher than that in the control group (0.74 鹵0.15)% and (1.56 鹵0.34)%, compared with that in the hMSC intervention group (P < 0. 05). There was significant difference (P < 0. 05). The expression level of Foxp3 mRNA was (0. 81 鹵0. 18) after adding L-NAME. It is concluded that no plays an important role in the inhibition of lymphocyte proliferation induced by allogeneic antigens by hMSC. The mechanism may be to promote apoptosis, affect the expression of FOXP3 and thus affect the function of regulatory T cells.
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R457;R392

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本文編號(hào)：2191180