【摘要】： ARMET (Arginine rich, mutated in early stage of tumors, ARMET)在公共數(shù)據(jù)庫中也稱為ARP(arginine-rich protein, ARP)或MANF (mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor, MANF),到目前為止,與ARMET相關(guān)的報道不多,其功能還不清楚。ARMET基因是從30000個基因中篩選出的對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ER stress)最敏感的基因,有人將其表達(dá)的蛋白稱為中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的促神經(jīng)生長因子(MANF)。但我們的研究發(fā)現(xiàn),中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞不是它的主要來源,它在腦內(nèi)的神經(jīng)元中廣泛表達(dá),且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激上調(diào)其表達(dá)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激存在于許多疾病中,ARMET作為一個分泌蛋白,可能成為血清學(xué)診斷的指標(biāo),所以快速血清學(xué)檢測方法的建立將為臨床相關(guān)疾病的早期輔助診斷提供及時的幫助。 目的: 本研究的目的是制備抗人ARMET單克隆抗體(mAb),并建立ELISA方法及相應(yīng)檢測試劑,為ARMET的生物學(xué)活性及功能研究提供便利條件,也為臨床相關(guān)疾病的早期輔助診斷提供幫助。 方法: 將pET28a-ARMET轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中,然后用IPTG誘導(dǎo)表達(dá),用預(yù)裝好的Ni-beads柱進(jìn)行純化,通過SDS-PAGE電泳及考瑪斯亮藍(lán)染色方法判斷融合蛋白的表達(dá)量及純度。將純化的ARMET免疫雌性BALB/c小鼠后采用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù),獲取分泌抗ARMET雜交瘤細(xì)胞株。體內(nèi)誘生腹水法制備mAb,間接ELISA法測定其效價及抗體亞型,辛酸-硫酸銨沉淀法及親和層析法純化mAb。用免疫熒光雙標(biāo)及western blot法對抗體的特異性進(jìn)行了鑒定。 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法制備檢測試劑盒。將克隆2G4產(chǎn)生的單克隆抗體稀釋為系列不同濃度后包被ELISA板,洗滌后加入稀釋成一定濃度的ARMET蛋白,同時設(shè)立空白對照,洗滌后加入兔抗ARMET多克隆抗體孵育,再加入HRP標(biāo)記的抗兔抗體,最后用酶標(biāo)儀測量OD450nm值。檢測正常雌雄大鼠、腦缺血大鼠、關(guān)節(jié)炎大鼠、關(guān)節(jié)炎兔及人外周血中的ARMET水平。 結(jié)果: 1.蛋白質(zhì)的表達(dá)與純化 ARMET蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物以可溶性形式存在。實(shí)驗(yàn)獲得了純度較高、濃度較高的融合蛋白。 2.抗ARMET單克隆抗體的制備及特異性研究 建立了7株穩(wěn)定分泌特異性抗ARMET單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,誘生腹水法獲得的抗體效價在1×10 5~1×10-7之間,且均有較好的特異性,純化后的抗體效價不變且純度較高。 3.檢測ARMET的ELISA方法的建立 雙抗體夾心ELISA法檢測ARMET的最小檢出限為5 ng/ml,標(biāo)準(zhǔn)曲線在5ng/ml ~100 ng/ml范圍內(nèi)線性良好。 4.正常雌、雄大鼠血清中ARMET水平的檢測 SPF級雄性正常SD大鼠血清中ARMET測量值為1.25μg/ml~2.3μg/ml,平均值為(1.67±0.46)μg/ml(n=5)。SPF級雌性正常SD大鼠血清中ARMET測量值為3.18μg/ml~5.08μg/ml,平均值為(4.22±0.77)μg/ml(n=5)。SPF級正常SD大鼠SPF級實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)場取血,外周血中未檢測到ARMET。 5.腦缺血大鼠外周血中ARMET的水平 大鼠腦缺血實(shí)驗(yàn)中使用的是普通級雄性SD大鼠,假手術(shù)組中大鼠血清中ARMET測量值為0.4μg/ml~2.8μg/ml,平均值為(1.66±1.01)μg/ml(n=4);手術(shù)組中大鼠血清中ARMET測量值為0.23μg/ml~3.91μg/ml,平均值為(1.74±0.93)μg/ml(n=15)。 6.關(guān)節(jié)炎大鼠外周血中ARMET的水平 大鼠關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)中使用的是普通級雄性SD大鼠,在致炎后的第2d、第7d、第14d、第21d、第28d測量血清中的ARMET水平。致炎后第2d大鼠血清中ARMET測量值為0.5μg/ml~1.2μg/ml,平均值為(1.02±0.39)μg/ml(n=4);致炎后第7d大鼠血清中ARMET測量值為0.7μg/ml~1.8μg/ml,平均值為(1.2±0.42)μg/ml(n=6);致炎后第14d大鼠血清中ARMET測量值為1.49μg/ml~2.42μg/ml,平均值為(1.92±0.41)μg/ml(n=6);致炎后第21d大鼠血清中ARMET測量值為0.7μg/ml~2.05μg/ml,平均值為(1.25±0.53)μg/ml(n=6);致炎后第28d大鼠血清中ARMET測量值為0.6μg/ml~1.70μg/ml,平均值為(1.16±0.41)μg/ml(n=6)。 7.關(guān)節(jié)炎兔外周血中ARMET的水平 兔關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)中,正常組雌性新西蘭白兔血清中ARMET水平為1.67μg/ml~5.78μg/ml,平均值為(4.21±2.21)μg/ml(n=3);模型組新西蘭白兔血清中ARMET測量值為178μg/ml~621μg/ml,平均值為(319.46±197)μg/m(ln=5);地塞米松治療組新西蘭白兔血清中ARMET測量值為134μg/ml~554μg/ml,平均值為(272.3±190)μg/ml(n=5);氯化釓治療組新西蘭白兔血清中ARMET測量值為87μg/ml~550μg/ml,平均值為(206.45±179.39)μg/ml(n=5)。 8.人外周血中ARMET的水平 成年男女正常血清中未檢測到ARMET(男20名,女20名),100例腫瘤患者血清中未檢測到ARMET。 結(jié)論已成功制備特異性較高的抗人ARMET單克隆抗體及ELISA檢測試劑盒,后者可測范圍廣,靈敏度和精密度均較高。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R392;R446.6

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2178507