【摘要】： 天冬酰胺合成酶屬于氨基轉(zhuǎn)移酶家族成員之一,可以催化合成天冬酰胺(ASN),從而為蛋白質(zhì)的合成提供原料。與正常的細(xì)胞相比,某些種類(lèi)的惡性淋巴細(xì)胞這種酶的活性很低,不能合成足夠量的天冬酰胺,需要依靠細(xì)胞外界環(huán)境中的天冬酰胺。本研究應(yīng)用已構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒pMS-ASNS表達(dá)MS2-ASNS融合蛋白,應(yīng)用細(xì)胞融合和雜交瘤技術(shù)制備抗人天冬酰胺合成酶單克隆抗體。獲得以下結(jié)果: 1. 42℃熱誘導(dǎo)法誘導(dǎo)融合蛋白MS2-ASNS的表達(dá),融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離、電洗脫、PBS透析獲得純化的融合蛋白MS2-ASNS,分子量約為55 kDa,與理論值一致。 2.應(yīng)用純化融合蛋白免疫BALB/C小鼠,取脾細(xì)胞應(yīng)用50%的PEG 3350與SP2/0細(xì)胞融合,融合效率為88%,陽(yáng)性率2.3%。分別用融合蛋白MS2-ASNS和MS2-PAI通過(guò)ELISA雙篩的方法4次篩選,最終篩選出3株穩(wěn)定分泌特異性抗人天冬酰胺合成酶單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為D10-9、F4-15和F4-16。3個(gè)細(xì)胞株體外傳代和凍存復(fù)蘇后抗體分泌穩(wěn)定。測(cè)定單克隆抗體的亞類(lèi)分別為IgG1、IgG2a和IgG2a。 3.用ELISA法鑒定抗體的特異性和效價(jià)。結(jié)果表明制備的抗體有很好的特異性,細(xì)胞株D10-9分泌的抗體效價(jià)為1:2×102 ,F4-15和F4-16分泌的抗體均達(dá)到1:5×105; Western-blot等方法鑒定抗體在K562和Hela細(xì)胞系中有很高親和力;采用IHC技術(shù)檢測(cè)天然ASNS在肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、BEL-7402、HepG2和胃癌細(xì)胞系SGC-7901、SGC-823及肺癌、宮頸癌、甲狀腺癌組織中均為胞漿表達(dá)。 本研究制備了抗ASNS單克隆抗體,初步檢測(cè)了ASNS在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá),為進(jìn)一步研究ASNS在中線(xiàn)鼻/鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Asparagine synthase is a member of aminotransferase family, which can catalyze the synthesis of asparagine (ASN), and provide raw materials for protein synthesis. Compared with normal cells, the enzyme activity of some kinds of malignant lymphocytes is very low, and it can not synthesize enough asparagine, which depends on the asparagine in the cell environment. In this study, the prokaryotic expression plasmid pMS-ASNS was used to express MS2-ASNS fusion protein, and the monoclonal antibody against human asparagine synthase was prepared by cell fusion and hybridoma techniques. The following results were obtained: 1. The fusion protein MS2-ASNSwas obtained by electroeluting the fusion protein by SDS-PAGE electrophoresis. The molecular weight of MS2-ASNSwas about 55 kDa, which was in agreement with the theoretical value. BALB/C mice were immunized with purified fusion protein. Spleen cells were fused with 50% PEG 3350 and SP2/0 cells. The fusion efficiency was 88 and the positive rate was 2.3%. Three hybridoma cell lines secreting monoclonal antibodies against human asparagine synthase were screened four times by ELISA double screen method with fusion protein MS2-ASNS and MS2-PAI, respectively. The antibody secretion of D10-9 F4-15 and F4-16.3 cell lines was stable after in vitro passage and cryopreservation and resuscitation. The subclasses of monoclonal antibody were IgG1, IgG2a and IgG2a.3, respectively. The specificity and titer of antibody were identified by ELISA method. The results showed that the antibody prepared by D10-9 had good specificity, and the titer of antibody secreted by cell line D10-9 was 1:2 脳 102F4-15 and F4-16, and the antibody secreted by F4-16 reached 1:5 脳 105.The antibody was identified by Western-blot method with high affinity in K562 and Hela cell lines. IHC technique was used to detect the cytoplasmic expression of natural ASNS in hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721 BEL-7402 HepG2, gastric cancer cell line SGC-7901hSGC-823, lung cancer, cervical cancer and thyroid carcinoma. In this study, monoclonal antibodies against ASNS were prepared, and the expression of ASNS in tumor cells was preliminarily detected, which laid a foundation for further study of the expression of ASNS in midline nasal / nasal NK/T cell lymphoma.
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2173627