【摘要】： 第一部分體外培養(yǎng)皮層神經(jīng)元及顯微鏡形態(tài)觀察 目的:研究皮層神經(jīng)元體外培養(yǎng)方法,了解其超微結(jié)構(gòu)特點 方法:取新生的SD大鼠,應(yīng)用機械分離法取下皮層組織,剪碎并應(yīng)用胰酶消化,離心取細胞懸液用含10%胎牛血清培養(yǎng),12小時之內(nèi)換用含2%B27無血清培養(yǎng),每三天換液一次,并在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)特征 結(jié)果:皮層神經(jīng)元剛接種時呈圓球形,4小時后就開始長出軸突,不過有點短,12個小時軸突進一步長長,胞體立體感強,透明發(fā)亮。到第4天軸突之間建立初步的聯(lián)系,第7天軸突之間已經(jīng)充分建立聯(lián)系,密密交織成網(wǎng)。 結(jié)論:在培養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定,無污染的條件下,12小時內(nèi)換液換用2%的B27來培養(yǎng)就可以成功的培養(yǎng)神經(jīng)元。 第二部分腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對谷氨酸損傷的皮層神經(jīng)元有保護作用 目的:探討腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)對由谷氨酸損傷的皮層神經(jīng)元有保護作用 方法:分組分別建立正常對照組,谷氨酸組和BDNF組,正常對照組就是按原先的方法培養(yǎng)皮層神經(jīng)元至第七天,谷氨酸組即為在培養(yǎng)至第六天的皮層神經(jīng)元中加入50μmol/L谷氨酸,30min后原培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)1天。BDNF組是在培養(yǎng)第5天的皮層神經(jīng)元的培養(yǎng)液中加入50 ng/ml的BDNF,作用24小時后換用含50μmol/L的谷氨酸培養(yǎng)基,30min后原培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時備檢測。用AO/EB免疫熒光染色法在熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)上的變化,應(yīng)用MTT來檢測細胞凋亡率的改變。 結(jié)果:谷氨酸組可見細胞突起皺縮、斷裂,并可見凋亡細胞產(chǎn)生,由于細胞膜的通透性被破壞,被EB染成紅色可見細胞核固縮狀或呈片段狀(圖3C)。BDNF組:破壞的細胞相對較少。MTT顯示:BDNF組的細胞凋亡較谷氨酸組明顯減低. MTT空白對照組(1.26±0.06)相比,谷氨酸組細胞活力(0.72±0.10)顯著降低(P0.05);而與谷氨酸組比較,BDNF組(1.14±0.06)可顯著提高細胞活力(P0.01)。谷氨酸組細胞凋亡比BDNF組明顯增多(P㩳0.05)。 討論:BDNF能夠保護皮層神經(jīng)元免受谷氨酸損傷 第三部分BDNF保護皮層神經(jīng)元的作用機制研究 目的:探討B(tài)DNF保護皮層神經(jīng)元免受谷氨酸損傷的機制 方法:將培養(yǎng)的細胞分為正常對照組,BDNF組,谷氨酸組,分別將各組細胞研磨,提取蛋白,用western-blot的方法檢測BDNF的低親和力受體p75NTR,下游信號分子JNK,ERK。 結(jié)果:BDNF組與谷氨酸組相比,p75NTR表達無明顯差異,BDNF組與谷氨酸組相比JNK表達明顯降低,ERK表達明顯增加。 討論:BDNF能夠保護谷氨酸引起的大腦皮層神經(jīng)元的損傷,其機制是通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元受體之間的比例,上調(diào)ERK,下調(diào)JNK,從而促進細胞的存活,降低細胞的凋亡。
[Abstract]:Part one: morphological observation of cortical neurons in vitro and microscopic observation objective: to study the methods of cortical neurons culture in vitro and to understand the ultrastructural characteristics of cortical neurons. The cortical tissue was removed by mechanical separation, the tissue was shredded and digested by trypsin, the cell suspensions were obtained by centrifugation and cultured with 10% fetal bovine serum for 12 hours with 27 serum-free culture. The morphological and structural characteristics of the cells were observed under microscope: the cortical neurons began to grow into axons 4 hours after inoculation, but the axons were a little short, and the axons were longer at 12 hours and had a strong sense of stereosome. Transparent and shiny. By the 4th day, the primary connection between axons was established, and on the 7th day, the connections between axons were fully established and closely intertwined into networks. Conclusion: under the condition of stable culture environment and no pollution, the neurons could be cultured successfully by using 2% B27 in 12 hours. Part two the protective effect of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) on cortical neurons injured by glutamate objective: to investigate the protective effect of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) on cortical neurons injured by glutamate. Methods: normal control group was established respectively. The glutamate group and the BDNF group, the normal control group, cultured cortical neurons in the same way until the seventh day. Glutamic acid group added 50 渭 mol/L glutamate to cortical neurons for 30 minutes after culture. BDNF group continued to culture for 1 day. BDNF group added 50 ng/ml BDNF into the culture medium of cortical neurons on the 5th day. After 24 hours of exposure, BDNF was added to the culture medium of cortical neurons. The glutamate medium containing 50 渭 mol/L was used for 30 minutes and the original medium was cultured for 24 hours. AO/EB immunofluorescence staining was used to observe the changes of cell morphology under fluorescence microscope and MTT was used to detect the change of apoptosis rate. Results: in Glutamic acid group, the processes were crumpled, broken, apoptotic cells were produced, and the permeability of cell membrane was destroyed. The nuclei were pyknotic or segmented by EB staining (fig. 3C) .BDNF group: the number of damaged cells was relatively small. MTT showed that the apoptosis of cells in the WBDNF group was significantly lower than that in the glutamic acid group. Compared with the control group (1.26 鹵0.06), the cell viability of glutamate group (0.72 鹵0.10) was significantly decreased (P0.05), while that of MTT group (1.14 鹵0.06) was significantly higher than that of glutamate group (P0.01). Apoptosis in glutamate group was significantly higher than that in BDNF group (P0. 05). Study on the mechanism of BDNF protecting cortical neurons from glutamic acid damage part 3: objective: to explore the protective effects of BDNF on cortical neuron immunity Mechanism of Glutamic Acid injury: cultured cells were divided into normal control group and BDNF group. In the glutamate group, the cells of each group were ground, the protein was extracted, the low affinity receptor p75NTR of BDNF was detected by western-blot, and the downstream signal molecule JNKN ERK was detected. Results there was no significant difference in the expression of p75NTR between the two groups. The expression of JNK in the BDNF group was significantly lower than that in the glutamate group. It is discussed that: BDNF can protect cerebral cortical neurons from glutamic acid-induced damage by regulating the ratio of neuron receptors, upregulating ERK and down-regulating JNKs, thus promoting cell survival and reducing cell apoptosis.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R33

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本文編號：2169002