【摘要】： 終末期肝衰竭仍然是困擾人類健康的一類頑疾,目前,它的治療主要依賴于原位肝移植(orthotopic liver transplantation,OLT),但是供體的極度短缺、移植及手術(shù)本身相關(guān)的死亡、終生服用免疫抑制劑及其所致的致死性并發(fā)癥等一系列問題極大地限制了這一治療手段的廣泛開展。細(xì)胞移植與生物人工肝(bioartificial liver,BAL)作為終末期肝病的替代、補(bǔ)充治療方法,不僅為患者尋求合適的供肝來源爭取到寶貴的時機(jī),甚至可以幫助患者平安渡過危險期,通過肝再生而自然恢復(fù)。令人遺憾的是,細(xì)胞來源受限、數(shù)量不足以及功能欠缺等仍是制約其進(jìn)一步發(fā)展的瓶頸問題。具有高度自我更新和發(fā)育全能性的人胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ES cells)在適宜的環(huán)境中可以向各種組織細(xì)胞分化,有望為生物人工肝、肝細(xì)胞移植、甚至肝組織工程等提供理想的種子細(xì)胞。然而,影響人ES細(xì)胞向肝細(xì)胞有效分化的因素及其調(diào)控機(jī)制、誘導(dǎo)分化效率及分化細(xì)胞的功能狀態(tài)等均存在許多不確定性,ES細(xì)胞應(yīng)用于臨床尚有許多難以逾越的障礙。本研究探討了誘導(dǎo)人ES細(xì)胞分化為具有合成、代謝、分泌及貯存等功能的肝細(xì)胞的方法,并通過遺傳修飾建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pAlb-EGFP的人ES細(xì)胞株,提供了純化目的細(xì)胞的手段,為人ES細(xì)胞在以細(xì)胞治療和基因治療為基礎(chǔ)的肝臟再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。 本研究主要包括三部分內(nèi)容。 一、細(xì)胞因子聯(lián)合胞外基質(zhì)誘導(dǎo)人ES細(xì)胞向肝系細(xì)胞分化我們采用以小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)作為飼養(yǎng)層,并摸索了兩種傳代方法(機(jī)械法和膠原酶法),建立了標(biāo)準(zhǔn)的人ES細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。 為進(jìn)一步探討人ES細(xì)胞肝向分化的潛能,我們在培養(yǎng)初期先將人ES細(xì)胞懸浮培養(yǎng)形成包含三胚層結(jié)構(gòu)的擬胚體(embryoid body,EB),然后將其接種到預(yù)先包被有Ⅰ型膠原的培養(yǎng)板上,以含有地塞米松、胰島素等的條件培養(yǎng)液進(jìn)行肝系誘導(dǎo)。形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表型變化及功能檢測等多方面結(jié)果表明,誘導(dǎo)后的部分細(xì)胞基本符合肝細(xì)胞的特征,證明人ES細(xì)胞具有向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化的潛能。 二、分階段富集聯(lián)合轉(zhuǎn)基因基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)人ES細(xì)胞向肝臟細(xì)胞分化 在前述試驗(yàn)研究中,我們證實(shí)了人ES細(xì)胞能夠在特定環(huán)境中向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化,但事實(shí)上分化的結(jié)果仍存在一定爭議。因?yàn)榕c成體干細(xì)胞有所不同,ES細(xì)胞具有更為特異的全能分化潛能,可以向內(nèi)、中、外三個胚層乃至胚外組織進(jìn)行分化,而臟壁內(nèi)胚層(visceral endoderm)可以表達(dá)許多與肝細(xì)胞相似的基因,但它只能夠參與形成胚外卵黃囊結(jié)構(gòu),并不能分化發(fā)育成肝臟或胰臟等實(shí)質(zhì)性器官,這為獲得真正意義上的肝細(xì)胞造成障礙。為此,本研究根據(jù)人ES細(xì)胞全能分化的特點(diǎn)及肝發(fā)育機(jī)制,設(shè)計了階段性富集聯(lián)合轉(zhuǎn)基因基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的新策略。首先形成包含了外層的原始內(nèi)胚層和內(nèi)層的原始外胚層的早期發(fā)育的簡單EB,在低血清的條件下,以高濃度的activin A誘導(dǎo)其向定型內(nèi)胚層的分化。RT-PCR和免疫熒光結(jié)果顯示,activin A作用3d的細(xì)胞高表達(dá)(80%)內(nèi)胚層標(biāo)志SOX17,而同時臟壁內(nèi)胚層的標(biāo)志α-甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)表達(dá)缺失,證明所獲細(xì)胞為定型內(nèi)胚層細(xì)胞。為進(jìn)一步探討定型內(nèi)胚層細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的潛能與機(jī)制,我們利用轉(zhuǎn)基因基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)模擬肝發(fā)育時的微環(huán)境。共培養(yǎng)11d后,形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表型變化及功能檢測等多方面結(jié)果表明,定型內(nèi)胚層細(xì)胞可以在bFGF和胎肝基質(zhì)細(xì)胞共同創(chuàng)造的環(huán)境中向肝系分化,并在HGF、OSM和Dex的作用下進(jìn)一步分化成熟,這一研究為獲得大量真正意義上的肝細(xì)胞開創(chuàng)了新的出路。 三、建立pAlb-EGFP遺傳修飾的人ES細(xì)胞株 如前所述,新的誘導(dǎo)策略排除了相似細(xì)胞的干擾,但所得細(xì)胞仍為一混合體,其致瘤、致癌等不可預(yù)知的風(fēng)險不容忽視。在本部分研究中,我們擬通過基因修飾人ES細(xì)胞,從而為今后的應(yīng)用研究提供純化目的細(xì)胞的手段。白蛋白(albumin,Alb)在肝臟發(fā)育早期及成體肝臟中均有所表達(dá),是識別肝細(xì)胞的一個較為特異的標(biāo)志。我們設(shè)計將含Alb啟動子調(diào)控增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的質(zhì)粒pAlb-EGFP轉(zhuǎn)入人ES細(xì)胞,由于該載體中含有一段neo抗性基因,所以可以通過G418條件培養(yǎng)進(jìn)行抗性篩選。通過條件培養(yǎng)基殺滅試驗(yàn)我們首先確定了G418篩選的最佳濃度(200μg/ml)。在此基礎(chǔ)上,我們利用EXGen 500轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染并實(shí)施抗性篩選,PCR結(jié)果證實(shí)篩選到的陽性克隆內(nèi)確實(shí)含有Alb-EGFP這段序列,證實(shí)為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,這一研究可能為日后的應(yīng)用增添新的純化肝細(xì)胞的工具。 人ES細(xì)胞向成熟的、有生理功能的肝細(xì)胞分化,為肝臟疾病的細(xì)胞治療提供了新的選擇。對于我們這樣一個病毒性肝炎及各種原因?qū)е碌慕K末期肝病高發(fā)的國家更具有特殊的意義。具有發(fā)育全能性的人ES細(xì)胞將為生物人工肝、肝(干/祖)細(xì)胞移植和以肝(干/祖)細(xì)胞為載體的基因轉(zhuǎn)移治療等提供優(yōu)良的種子細(xì)胞,借助核移植技術(shù)和現(xiàn)有的ES細(xì)胞庫等資源有望在肝臟疾病的治療中發(fā)揮更大的作用,而現(xiàn)代生物科學(xué)及其相關(guān)技術(shù)在該領(lǐng)域中的應(yīng)用勢必將加快其在臨床移植修復(fù)治療中的應(yīng)用進(jìn)程。
[Abstract]:End-stage liver failure is still a kind of stubborn disease that plagued human health. At present, its treatment relies mainly on orthotopic liver transplantation (OLT), but the extreme shortage of donor, the death of transplantation and operation itself, the lifetime taking of immunosuppressant and its fatal complications are a great deal of problems. It restricts the extensive development of this treatment. Cell transplantation and bioartificial liver (BAL) as an alternative to end-stage liver disease, supplemental therapy, not only for patients to seek the appropriate source of liver supply for the precious opportunity, but also help patients safely through the risk period, the natural recovery through liver regeneration. It is regrettable that the limited cell source, insufficient number and lack of function are still the bottlenecks that restrict its further development. Human embryonic stem cells (embryonic stem cells, ES cells), with high self renewal and developmental omnipotent, can differentiate into various tissues and cells in a suitable environment, and are expected to be biological artificial liver and liver cells. Transplantation, even liver tissue engineering provides ideal seed cells. However, there are many uncertainties in the factors affecting the effective differentiation of human ES cells to hepatocytes, the induction of differentiation efficiency and the functional status of differentiated cells. The application of ES cells to the many insurmountable obstacles in clinical Shang Youxu. This study explored the induction of human E S cells differentiate into hepatocytes with functions such as synthesis, metabolism, secretion and storage, and establish a human ES cell line that stably transfect pAlb-EGFP through genetic modification, providing a means to purify the target cells, which lays the foundation for the application of human ES cells in the liver regenerative medicine based on cell therapy and gene therapy.
This study mainly includes three parts.
First, the cytokine combined with extracellular matrix induced human ES cells to differentiate into liver cells. We used mouse embryonic fibroblast (MEF) as a feeder layer, and explored two methods of generation (mechanical and collagenase), and established a standard human ES cell culture system.
In order to further explore the potential of human ES cells to liver differentiation, we first suspended human ES cells in the early stage of culture to form a embryoid body (embryoid body, EB) containing the structure of the germ layer, and then inoculated them into a culture plate with type I collagen in advance, and induced the liver system with the conditioned medium containing dexamethasone and insulin. Multifaceted results, such as state of state, cell phenotype change and functional detection, show that the induced part of the cells basically conforms to the characteristics of hepatocytes, proving that human ES cells have the potential to differentiate into hepatocyte like cells.
Two, the enrichment of human ES cells into hepatocytes by co culture of co cultured transgenic stromal cells in different stages.
In the previous experimental study, we have confirmed that human ES cells can differentiate into hepatocyte like cells in a specific environment, but the result of differentiation is still in dispute. Because different from adult stem cells, ES cells have a more specific omnipotent differentiation potential and can differentiate into three outer and outer tissues from the inner, middle and outer cells. The dirty wall endoderm (visceral endoderm) can express many genes similar to the liver cells, but it can only participate in the formation of the outer yolk sac structure, and can not differentiate into liver or pancreas and other parenchymal organs, which can cause obstacles to the real liver cells. Therefore, this study is based on the characteristics of the total differentiation of human ES cells. As well as the mechanism of liver development, a new strategy for co culture of phase enrichment and transgenic stroma cells was designed. First, a simple EB was formed for the early development of the primitive ectoderm containing the outer layer of the endoderm and the inner layer. Under the condition of low serum, the differentiation of.RT-PCR and immunofluorescence to the stereotypical endoderm was induced by high concentration of A. The results showed that the cells of activin A expressed high expression of 3D (80%) the endoderm marker SOX17, while the expression of alpha fetoprotein (alpha-fetoprotein, AFP) in the inner endoderm was missing, which proved that the cells were stereotypical endoderm cells. In order to further explore the potential and mechanism of the differentiation of the endoderm cells to the liver cells, we use the transgenic cells. The matrix cell co culture system simulates the microenvironment in the development of liver. After co culture of 11d, the morphology, cell phenotype changes and functional detection results show that the stereotypical endoderm cells can differentiate into the liver in the environment created by bFGF and fetal liver stromal cells, and further differentiate and mature under the action of HGF, OSM and Dex. The research has opened up a new way to get a lot of real hepatocytes.
Three, the establishment of pAlb-EGFP genetically modified human ES cell line
As mentioned earlier, the new induction strategy excludes the interference of similar cells, but the cells are still a mixture, and the unpredictable risks such as tumorigenesis and carcinogenesis can not be ignored. In this part, we intend to modify human ES cells by gene modification to provide a means to purify the target cells for future application. Albumin (albumin, Alb) is in the present study. In the early stage of liver development and in the adult liver, it is a specific marker to identify the liver cells. We designed plasmid pAlb-EGFP containing the Alb promoter to regulate the enhanced green fluorescent protein (EGFP) gene into human ES cells, because the vector contains a segment of the Neo resistance gene. Resistance screening can be carried out through G418 conditions. We first identified the optimum concentration of G418 screening (200 mu g/ml) through the conditional culture medium killing test. On this basis, we used EXGen 500 transfection reagent to transfect and carry out resistance screening. PCR results confirmed that the screened positive clones did contain Alb-EGFP sequence. Stable transfection may provide new tools for purify hepatocytes in future applications.
The differentiation of human ES cells to mature and physiological liver cells provides a new choice for the treatment of liver disease cells. It is of great significance for a country with high incidence of end-stage liver disease caused by viral hepatitis and various causes. Human ES cells with developmental omnipotence will be bioartificial liver, liver (dry / progenitor). Cell transplantation and gene transfer therapy for liver (stem / progenitor) cells provide excellent seed cells. Nuclear transplantation and existing ES cell banks are expected to play a greater role in the treatment of liver diseases. The application of modern biological science and its related technologies in this field will certainly accelerate its clinical migration. The application process in plant repair.
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R329

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本文編號：2160037