【摘要】：研究背景：全球目前有近三分之一的人口感染了結(jié)核分枝桿菌(Mtb)，其中5~10%可發(fā)展為結(jié)核病(TB)，而且TB仍是近年來世界上因感染單一病原體而死亡的最重要病因之一。如何快速診斷出結(jié)核病是治療結(jié)核、控制結(jié)核的重點項目之一。檢測結(jié)核桿菌感染的試劑盒(T-SPOT-TB)根據(jù)免疫應(yīng)答及回憶反應(yīng)的原理，用ESAT6/CFP10刺激CD4+T細胞產(chǎn)生IFN-γ，但這種試劑盒不能區(qū)分Mtb隱匿性感染者(以下簡稱隱感者)與TB患者。近年已證實了γδT細胞在結(jié)核感染中的免疫作用。γδT細胞對Mtb抗原的刺激有增殖反應(yīng)并產(chǎn)生IFN-γ。與正常人(HD)或隱感者相比，TB患者γδT細胞對Mtb抗原刺激后的增殖反應(yīng)降低，而γδT細胞產(chǎn)生IFN-γ(Tγδ1細胞)的能力有何不同尚不清楚。已報道不同細胞因子可誘導小鼠γδT細胞產(chǎn)生IL-17(Tγδ17細胞)。但誘導人γδT細胞產(chǎn)生IL-17的調(diào)控機制以及Mtb抗原的影響，也還有待探討。 目的：檢測HD，TB患者經(jīng)分離外周血單個核細胞（PBMC）培養(yǎng)增殖后用Mtb-HAg刺激后T細胞亞群產(chǎn)生IFN-γ和IL-17的變化。觀察不同細胞因子和Mtb抗原在誘導γδT細胞產(chǎn)生IL-17中的作用。以闡明隱感者和TB患者之間γδT細胞的天然和特異性免疫的差異，以及為TB患者不同病程期間的免疫功能狀態(tài)提供新的判定指標。 方法：1.流式細胞術(shù)檢測Mtb-Ag刺激γδT細胞產(chǎn)生IFN-γ 1.1采集3例HD外周血，，加入Mtb-HAg刺激培養(yǎng)10h，14h，18h后，再加入莫能霉素（Monensin）繼續(xù)培養(yǎng)6h，收集細胞，加入熒光標記單抗進行表面分子和胞內(nèi)染色，流式細胞儀檢測產(chǎn)生IFN-γ的T細胞亞群比例。 1.2采集隱感者和TB患者外周血，分別用磷酸化抗原HDMAPP、Mtb-HAg和Mtb-HAg(10K)刺激培養(yǎng)14h，再加入莫能霉素（Monensin）繼續(xù)培養(yǎng)6h，收集細胞，加入熒光標記單抗進行表面分子和胞內(nèi)染色，流式細胞儀檢測產(chǎn)生IFN-γ的T細胞亞群比例。 1.3收集HD和TB患者外周血分離PBMC經(jīng)培養(yǎng)增殖12天后的細胞，用或不用Mtb-HAg刺激培養(yǎng)2h，再加入莫能霉素（Monensin）繼續(xù)培養(yǎng)4h，收集細胞，加入熒光標記單抗進行表面分子和胞內(nèi)染色，流式細胞儀檢測γδT細胞中產(chǎn)生IFN-γ和IL-17細胞的相對比例。 2.ELISPOT方法檢測隱感者和TB外周血T細胞亞群產(chǎn)生IFN-γ和IL-17 2.1運用結(jié)核桿菌感染T細胞酶聯(lián)免疫斑點診斷試劑盒從HD人群中篩選隱感者，采集HD外周血分離PBMC調(diào)整細胞數(shù)，按實驗設(shè)計每孔加入細胞懸液將ELISPOT板置于37℃培養(yǎng)20h后，進行洗滌孵育顯色，最后進行斑點計數(shù)統(tǒng)計，每10萬個細胞中產(chǎn)生IFN-γ細胞數(shù)。 2.2采集隱感者和TB患者外周血分離PBMC，取一部分細胞進行免疫磁珠的分選收集無γδT細胞（γδˉ）的PBMC，再將這兩部分細胞調(diào)整細胞數(shù)按實驗設(shè)計每孔加入細胞懸液將ELISPOT板置于37℃培養(yǎng)20h后，進行洗滌孵育顯色，最后進行斑點計數(shù)統(tǒng)計，每10萬個細胞中產(chǎn)生IFN-γ和IL-17細胞數(shù)。 3.Mtb-Ag和細胞因子(CK)對γδT細胞激活誘導產(chǎn)生IL-17和IL-17㧏IL-22㧏采集HD外周血分離PBMC，加入Mtb-HAg、HDMAPP、Mtb-SoAg和細胞因子（IL-1β、TGF-β）培養(yǎng)3天后，加入rIL-2刺激培養(yǎng)，第9天加入IL-23繼續(xù)培養(yǎng)至12天，使其成為富含效應(yīng)性γδT細胞的細胞群，收集細胞用PMA/Ionomycin和Monensin刺激培養(yǎng)6h，流式細胞儀檢測產(chǎn)生IL-17和IL-17+IL-22+的γδT細胞亞群比例。 結(jié)果：1.Mtb-HAg刺激HD外周血（n＝3）第16h開始，γδT細胞中產(chǎn)生IFN-γ的細胞逐漸增多，至20h時和24h時，分別為3.33%和3.50%。 2、用Mtb感染T細胞診斷ELISPOT試劑盒檢測從HD人群中篩選隱感者，利用判定陽性標準從17例HD人群中篩選出11例隱感者。 3、隱感者經(jīng)不同抗原刺激20h后用流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，αβT細胞和γδT細胞均能產(chǎn)生IFN-γ，而產(chǎn)生IFN γ的γδT細胞比αβT細胞多。αβT細胞和γδT細胞中IFN-γ+細胞比率在HDMAPP刺激組（n＝6）（0.45%和7.42%），Mtb-HAg刺激組（n＝11）（0.42％和5.63％），Mtb-HAg(10K)組（n＝8）（0.61％和7.6％）中比較，均有明顯差異（p0.05）。TB患者經(jīng)不同抗原刺激20h后，γδT細胞中產(chǎn)生IFN-γ細胞也比αβT細胞中的多。在HDMAPP刺激組（n＝6）（2.0%，3.35%），Mtb-HAg刺激組（n＝12）（0.87％和2.11％），Mtb-HAg(10K)組（n＝10）（0.64％和2.35％）。各實驗組中αβT細胞和γδT細胞中IFN-γ+細胞比率的比較均有明顯差異（p0.05）。進一步分析發(fā)現(xiàn)，Mtb-HAg刺激后TB患者γδT細胞中IFN-γ產(chǎn)生細胞的比例顯著低于隱感者。 4、運用ELISPOT方法檢測隱感者（n＝11）和TB（n＝11）患者IFN-γ和IL-17兩種細胞因子，隱感者和TB患者比較，經(jīng)PHA刺激，IFN-γ和IL-17兩種細胞因子，TB患者比隱感者產(chǎn)生的要少，兩者有明顯差異p0.05。 5、HD和TB患者經(jīng)PBMC培養(yǎng)增殖12天，用Mtb-HAg再刺激用流式細胞術(shù)檢測γδT細胞IFN-γ+細胞比率。HD和TB患者用或不用Mtb-HAg再刺激檢測IFN-γ比較有差異顯著性p0.05。 6、不同抗原刺激和極化培養(yǎng)Tγδ17細胞的比較，Mtb-HAg+CK組比Mtb-HAg組明顯升高，兩組有明顯差異（p0.05），HDMAPP+CK組比HDMAPP組明顯升高，兩組有明顯差異（p0.05），Mtb-SoAg和Mtb-SoAg+CK組則無差異性。 結(jié)論：1.Mtb-HAg刺激HD外周血γδT細胞產(chǎn)生IFN-γ的最適時間是20h。 2.流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明，Mtb-HAg刺激后隱感者和TB患者的外周γδT細胞中產(chǎn)生IFN-γ的細胞均顯著高于αβT細胞。 3.流式細胞術(shù)和ELISPOT檢測均表明，隱感者γδT細胞中產(chǎn)生IFN-γ細胞均比TB患者的高。 4.免疫磁珠負選法和ELISPOT檢測初步表明隱感者γδT細胞中產(chǎn)生IL-17細胞比TB患者的高。 5.HD和TB患者經(jīng)PBMC培養(yǎng)增殖后，經(jīng)Mtb-HAg刺激后γδT細胞中產(chǎn)生IFN-γ的細胞明顯增多，而產(chǎn)生IL-17細胞經(jīng)刺激后是下降的。 6.HD外周血分離PBMC，Mtb-HAg、磷酸抗原（HDMAPP）激活γδT細胞同時加入含誘導性細胞因子（IL-1β，TGF-β，IL-23），可誘導Tγδ17細胞的分化和增殖，而Mtb-SoAg則不能有效的誘導Tγδ17細胞細胞的分化和增殖。
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【學位授予單位】：蚌埠醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R378.911;R392

【參考文獻】

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本文編號：2158412