【摘要】： 研究背景和目的:神經干細胞(Neural Stem Cells,NSCs)移植和基因治療,是治療缺血性腦血管疾病的兩個重要的研究途徑。近年來,神經干細胞已經被用作基因治療的載體,可將治療基因攜帶到病灶,通過治療基因在缺血性損傷局部表達而發(fā)揮作用,有望為中風的治療帶來新的希望。本研究的目的:以慢病毒(Lentivirus,LV)介導,將hNT-3基因轉入NSCs,并進行體外培養(yǎng),探討NSCs-hNT3在體外分化以及表達NT-3時間上的特點,為體內移植NSCs-hNT3的研究和臨床應用提供必要的體外實驗依據(jù)。 方法:實驗共分二部分。第一部分:從孕14天Sprague-Dawley(S-D)大鼠胚胎的腦組織分離出神經干細胞,采用無血清培養(yǎng)法,進行體外培養(yǎng)、擴增,并通過免疫熒光化學染色(巢蛋白)進行鑒定。取傳至第5～6代神經干細胞,以1×10~5 cells/500μl/孔接種于24孔板,分別按復感染指數(shù)(Multiplicities of infection,MOIs值)為0、1、5、10、15、20加入攜帶報告基因GFP的慢病毒載體(lentiviralvector-GFP,LV/GFP)稀釋液,每一滴度加六孔,共六組。2～3天后于倒置熒光顯微鏡下觀察各組GFP的表達效率,并在3天后進行神經干細胞球進行計數(shù),觀察LV/GFP對NSCs增殖的影響。并行流式細胞儀檢測,得出各組NSCs的GFP陽性轉染率。第二部分:構建表達hNT-3基因的慢病毒載體(lentiviral vector-hNT-3,LV/hNT-3),實驗組根據(jù)最佳MOI用LV/hNT-3轉染NSCs,對照組NSCs不轉染病毒。兩組細胞繼續(xù)無血清培養(yǎng),48h～96h后,應用ELISA和免疫熒光染色方法對兩組NSCs在體外的分化和NT-3的表達進行檢測。 結果:第一部分:NSCs以懸浮細胞球方式生長,nestin染色陽性。轉染GFP基因后,除MOI值為0的對照組外,2～3天后各孔均有GFP表達。MOI值從0增至10,細胞的陽性表達率逐漸提高(P＜0.05),MOI值為10的組能獲得＞85%的轉染率。但MOI值從10增至20,形成的神經干細胞球數(shù)目卻逐漸減少。第二部分:NT-3修飾的神經干細胞早期跟親代無形態(tài)學區(qū)別,3-4天后,實驗組中神經干細胞分化比例比對照組明顯要高,已分化的細胞在形態(tài)上與對照組比較:細胞突起長而且數(shù)量多,細胞間突觸聯(lián)系多。轉NT-3組神經干細胞,向神經元方向分化的比例明顯高于對照組。 結論: 1) LV是將外源基因轉入神經干細胞的理想載體。以MOI為10的滴度,LV可將外源基因高效轉入神經干細胞內。 2)慢病毒介導轉染神經營養(yǎng)素-3基因的神經干細胞體外培養(yǎng),能高效表達NT-3,向神經元方向分化比例增多,且能形成的突起較長,數(shù)量多。
[Abstract]:Background and objective: neural stem cell (Neural Stem) transplantation and gene therapy are two important approaches in the treatment of ischemic cerebrovascular diseases. In recent years, neural stem cells have been used as gene therapy vectors, which can carry the therapeutic gene to the focus and play a role through the local expression of therapeutic gene in ischemic injury, which may bring new hope for the treatment of apoplexy. The purpose of this study was to transfer hNT-3 gene into NSCs mediated by lentivirus LV and culture in vitro, to explore the characteristics of NSCs-hNT3 differentiation and expression of NT-3 in vitro, and to provide the necessary in vitro experimental basis for the study and clinical application of NSCs-hNT3 transplantation in vivo. Methods: the experiment was divided into two parts. The first part: neural stem cells were isolated from the brain of Sprague-Dawley (S-D) rat embryos on the 14th day of gestation. The neural stem cells were cultured in vitro and amplified by serum-free culture. The neural stem cells were identified by immunofluorescence staining (nestin). Neural stem cells (NSCs) were transferred to the 5th generation and inoculated with 24 well plates with 1 脳 10 ~ (5) cells/500 渭 l / well. According to the multiple infection index (Multiplicities of), they were added to the dilution solution of lentiviralvector-GFP / GFP / GFP carrying the reporter gene GFP, respectively, and were added to the dilution solution of lentiviralvector-GFPV / GFP with six holes in each titer, according to the multiple infection index (Multiplicities of). The expression efficiency of GFP was observed under inverted fluorescence microscope after 3 days in six groups. The neural stem cell spheres were counted 3 days later to observe the effect of LV/GFP on the proliferation of NSCs. The positive transfection rate of NSCs was obtained by flow cytometry. In the second part, lentiviral vector-hNT-3 / LV- / hNT-3 was constructed. The experimental group was transfected with LV/hNT-3 according to the optimal MOI, while the control group (NSCs) was not transfected with the virus. The differentiation of NSCs and the expression of NT-3 in the two groups were detected by ELISA and immunofluorescence staining after 48h and 96h of serum-free culture. Results: in the first part, NSCs grew in the form of suspension cells and positive staining for nestin. After transfection of GFP gene, the expression of GFP was increased from 0 to 10 in every pore 3 days after transfection, and the positive expression rate of the cells increased gradually (P < 0. 05) in the control group with a MOI value of 0. The transfection rate was more than 85% in the control group with a MOI value of 10 (P < 0. 05). However, when MOI increased from 10 to 20, the number of neural stem cell balls gradually decreased. Part two: NT-3 modified neural stem cells had no morphological difference from their parents at the early stage. After 3-4 days, the proportion of neural stem cells differentiated in the experimental group was significantly higher than that in the control group. Compared with the control group, the differentiated cells had longer and more processes and more synaptic connections. The percentage of neural stem cells differentiated into neurons in NT-3 group was significantly higher than that in control group. Conclusion: 1) LV is an ideal vector for the transfer of exogenous gene into neural stem cells. When the titer of MOI was 10, the exogenous gene could be efficiently transferred into neural stem cells. 2) lentivirus mediated neural stem cells transfected with neurotrophin 3 gene could express NT-3 efficiently and differentiate into neurons. And can form a long, large number of protrusions.
【學位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R329

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