【摘要】： 前言 鋅是機體必需的微量元素之一,是體內(nèi)許多金屬結(jié)合蛋白和細胞發(fā)揮正常功能的必要成分。鋅離子不能自由穿越細胞膜,其跨膜轉(zhuǎn)運需要特定的鋅離子轉(zhuǎn)運蛋白介導,以維持細胞內(nèi)鋅離子的穩(wěn)態(tài)。鋅轉(zhuǎn)運體ZnT8屬于SLC30家族,克隆自SLC30A8基因(染色體8q24.11),是一段含有369個氨基酸片段的蛋白。在胰島素合成過程中,存在于胰島素分泌小泡上的ZnT8使鋅離子進入小泡參與鋅胰島素六聚體的形成,進而參與細胞完成胰島素形成和儲存的過程。因為ZnT8在胰島alpha細胞、甲狀腺腺泡上皮細胞、腎上腺皮質(zhì)細胞等內(nèi)分泌細胞也有表達,所以ZnT8被認為是一種與內(nèi)分泌細胞有緊密聯(lián)系的鋅轉(zhuǎn)運體。本研究中,我們探討了ZnT8在生殖系統(tǒng)的內(nèi)分泌細胞內(nèi)的表達,進一步驗證ZnT8與內(nèi)分泌細胞的關(guān)系。 材料與方法 選取健康CD-1成年小鼠30只(雄性和雌性各半,體重20-25克,購自中國醫(yī)科大學實驗動物部),給予充足的食物和自來水。 使用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)在mRNA水平檢測ZnT8在睪丸和卵巢的表達,用1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR的產(chǎn)物。運用免疫組織化學染色技術(shù)檢測ZnT8在睪丸的表達。應用金屬自顯影(AMG)組織化學染色技術(shù)顯示游離鋅離子在睪丸和卵巢兩種組織中的分布。應用免疫熒光染色技術(shù)驗證ZnT8和StAR蛋白在睪丸Leydig細胞和次級卵泡顆粒細胞的共存。 實驗結(jié)果 1、ZnT8 mRNA在睪丸和卵巢表達的RT-PCR結(jié)果 RT-PCR結(jié)果顯示在250bp和500bp之間(ZnT8引物的大小為323bp)的位置上出現(xiàn)了清楚的條帶,表明ZnT8 mRNA在睪丸和卵巢的表達。 2、ZnT8蛋白在睪丸分布與表達的免疫組化結(jié)果 與陰性對照組比較,ZnT8蛋白主要分布于睪丸曲精小管之間的Leydig細胞,同時,在曲精小管的基底部的精原細胞也有ZnT8蛋白分布。 3、鋅離子在睪丸分布的AMG結(jié)果 睪丸的鋅離子分布有向曲精小管中心集中的趨勢。在曲精小管基底部和曲精小管之間Leydig細胞中,也可以觀察到游離鋅離子的分布。 4、鋅離子在卵巢分布的AMG結(jié)果 卵巢的游離鋅離子廣泛分布于卵巢黃體、初級卵泡和次級卵泡。在次級卵泡,卵母細胞和卵泡膜內(nèi)側(cè)的顆粒細胞內(nèi)有大量鋅離子分布。 5、睪丸Leydig細胞和卵巢次級卵泡的ZnT8免疫熒光結(jié)果 在睪丸的Leydig細胞和卵巢次級卵泡的顆粒細胞層上進行ZnT8和StAR的免疫熒光雙標檢測,結(jié)果顯示ZnT8和StAR蛋白共存于這兩種類固醇激素分泌細胞。 結(jié)論 1、ZnT8 mRNA和蛋白在睪丸和卵巢中均有表達。 2、ZnT8在睪丸中的表達存在特異性,主要集中于Leydig細胞。3、ZnT8在睪丸和卵巢中的表達都與StAR蛋白存在位置上的相關(guān)性。
[Abstract]:Zinc is one of the essential trace elements in the body, and it is necessary for many metal binding proteins and cells to function normally. Zinc ions can not cross the cell membrane freely, and their transmembrane transport requires specific zinc ion transporter to maintain the homeostasis of zinc ions in cells. Zinc transporter ZnT8 belongs to SLC30 family. It is cloned from SLC30A8 gene (chromosome 8q24.11) and is a protein containing 369 amino acid fragments. In the process of insulin synthesis, ZnT8, which exists on the insulin-secreting vesicles, makes zinc ions enter the vesicles to participate in the formation of zinc hexamers, and then participate in the process of insulin formation and storage in cells. Because ZnT8 is also expressed in islet alpha cells, thyroid acinar epithelial cells, adrenal cortical cells and other endocrine cells, ZnT8 is considered to be a zinc transporter closely related to endocrine cells. In this study, we investigated the expression of ZnT8 in endocrine cells of reproductive system and further confirmed the relationship between ZnT8 and endocrine cells. Materials and methods 30 healthy CD-1 adult mice (male and female, weighing 20-25 g) were selected and given sufficient food and tap water. Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to detect the expression of ZnT8 in testis and ovaries at mRNA level. The products of PCR were separated by 1% agarose gel electrophoresis. Immunohistochemical staining technique was used to detect the expression of ZnT8 in testis. The distribution of free zinc ions in testis and ovaries was demonstrated by (AMG) histochemical staining. The coexistence of ZnT8 and StAR protein in testicular Leydig cells and secondary follicular granulosa cells was confirmed by immunofluorescence staining. Results 1 RT-PCR results of mRNA expression in testis and ovaries RT-PCR showed that there were clear bands between 250bp and 500bp (the size of ZnT8 primer was 323bp). 2Immunohistochemical results of the distribution and expression of ZnT8 mRNA protein in testis were mainly located in testicular seminiferous cells compared with the negative control group. Leydig cells between tubes, At the same time, ZnT8 protein was also distributed in spermatogonia at the base of seminiferous tubules. 3. Zinc ions distributed in testis by AMG. The results showed that the distribution of zinc ions in testis tended to be concentrated towards the center of seminiferous tubules. In Leydig cells at the base of seminiferous tubules and between seminiferous tubules, The distribution of free zinc ions was also observed. 4. Zinc ions were distributed in the ovarian AMG results the free zinc ions of the ovary were widely distributed in the corpus luteum primary follicles and secondary follicles. In secondary follicles, A large number of zinc ions were distributed in oocytes and granulosa cells inside the follicular membrane. 5. ZnT8 immunofluorescence of testis Leydig cells and ovarian secondary follicles was found in Leydig cells of testis ZnT8 and StAR in granulosa cell layer of ovarian secondary follicles were detected by immunofluorescence double labeling. The results showed that ZnT8 and StAR proteins co-existed in these two steroid hormone secreting cells. Conclusion 1ZnT8 mRNA and protein were expressed in testis and ovary, 2the expression of ZnT8 was specific in testis. The expression of ZnT8 in testis and ovaries was mainly related to the location of StAR protein in Leydig cells.
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R341

【共引文獻】

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本文編號：2153570