【摘要】： 目的和意義 克隆肝螺桿菌(Helicobacter hepaticus,Hh)甲基基團(tuán)接受趨化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(methyl-accepting chemotaxis signal transduction protein,MCP)基因,制備MCP重組蛋白作為抗原,從而制備ELISA檢測試劑盒檢測Hh感染者血清中的特異性免疫球蛋白,為檢測我國人群肝螺桿菌感染率及探討人類肝臟疾病和腸道非特異性炎癥的病因提供實驗基礎(chǔ)。 材料和方法 1、主要材料:肝螺桿菌菌株,原核表達(dá)質(zhì)粒pET22b(+),抗His單克隆抗體,空腸彎曲菌選擇性血瓊脂培養(yǎng)基,鎳親和層析柱,辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG,辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗人IgG。 2、方法 2.1引物設(shè)計 根據(jù)GenBank選取肝螺桿菌基因HH1088中的一段長為255bp的保守區(qū)基因片段(即MCP),利用Primer Premier 5.0設(shè)計引物,上游(C255F)5'GACGAATTC C GTAGAGCAAGGGGATTTC 3'(含EcoRI酶切位點),下游(C255R)5'CGC CTCGAG TCTTTGTTTGAGCATTTT 3'(含XhoI酶切位點),以肝螺桿菌全基因組為模板,進(jìn)行PCR擴增。 2.2 MCP基因原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 肝螺桿菌保種菌液(由本實驗室保存)取100μl涂布于空腸彎曲菌選擇性血瓊脂培養(yǎng)基(含7%凍融脫纖維羊血,選擇性抗生素萬古霉素10mg/L,多粘菌素B 2500單位/L,二性霉素B 10mg/L,TMP 5mg/L),37℃微需氧條件(5%O_2,10%CO_2及85%N_2)下培養(yǎng),每天觀察有無菌落生長。將透明、針尖大小的菌落用棉簽刮至EP管中,PBS沖洗三次后,用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提肝螺桿菌DNA。以肝螺桿菌全基因組DNA為模板,用Hotstart酶進(jìn)行PCR擴增,反應(yīng)條件為94℃30min總變性,94℃30s,50℃30s,72℃45s,共35個循環(huán),72℃10min總延伸。所得目的片段回收后在限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI作用下37℃水浴1小時進(jìn)行酶切反應(yīng),插入至原核表達(dá)載體pET22b(+)的EcoRI和XhoI之間,所得質(zhì)粒命名為pET22b+/MCP,經(jīng)酶切及PCR鑒定后進(jìn)行測序。 2.3 MCP基因在大腸桿菌中的表達(dá) 將重組質(zhì)粒pET22b+/MCP轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)BL21(DE3),挑單克隆接種于10ml含氨芐青霉素100μg/ml的LB培養(yǎng)基,37℃200rpm培養(yǎng)3個半小時至OD_(600)約為0.6-1.0。轉(zhuǎn)接100μl于10ml含氨芐青霉素100μg/ml的LB培養(yǎng)基中,37℃200rpm培養(yǎng)1個半小時至OD_(600)約為0.6,加入500mmol/L IPTG至終濃度為1mmol/L,37℃180rpm培養(yǎng)4個小時。將誘導(dǎo)菌液12000rpm 4℃離心5min,取1ml菌液沉淀進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。重組蛋白rhMCP包含表達(dá)載體pET22b(+)中的6×His標(biāo)簽,因此用Western blot對rhMCP的表達(dá)再次進(jìn)行鑒定。 2.4 rhMCP蛋白的純化 取1000ml誘導(dǎo)表達(dá)的菌液,12000rpm 4℃離心5min,菌體沉淀加入1/20細(xì)菌生長體積的細(xì)菌裂解液和PMSF,冰上超聲破碎細(xì)菌,10000rpm 4℃離心15min。棄上清,往沉淀中加入1/20細(xì)菌生長體積的UrNTA-0 Buffer和PMSF,將細(xì)胞懸浮,室溫放置30min,10000rpm 4℃離心15min,取上清。用30ml的UrNTA-0 Buffer平衡3mlNTA層析柱,上清液上柱,收集穿透部分,用于SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)的結(jié)合情況。15ml UrNTA-0 Buffer洗脫未結(jié)合部分,然后分別用15mlUrNTA-20,UrNTA-40,UrNTA-60,UrNTA-100,UrNTA-200,UrNTA-500洗脫,收集洗脫液,用SDS-PAGE確定目標(biāo)蛋白質(zhì)在洗脫液中的分布情況。用梯度PBS-尿素4℃透析(6M-4M-2M-1M),每4小時換液一次,最后用PBS 4℃透析24小時。BCA法測蛋白濃度,-70℃保存。 2.5小鼠H.hepaticus感染血清學(xué)分析 購買裸鼠21只,其中出生2-3天的乳鼠9只;NIH孕鼠2只,其后解剖NIH悉生鼠24只,NIH普通小鼠6只(均購于南方醫(yī)科大學(xué)動物中心),一方面取結(jié)腸組織提取基因組DNA后,以C255F/C255R特異性引物進(jìn)行PCR擴增,所得PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定,陽性者進(jìn)一步測序鑒定;另一方面經(jīng)心臟或頸動脈取血,血液置于EP管中室溫靜置2小時,2000rpm離心15min后取血清,-80℃保存。在棋盤滴定法確定最佳包被濃度和樣品最佳稀釋度后,以純化的蛋白rhMCP 5μg/ml包被酶標(biāo)板,每孔200μl,設(shè)復(fù)孔,4℃過夜;次日順序加入1∶100稀釋的小鼠血清、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶10000稀釋)、最后加入底物OPD顯色,終止反應(yīng)后用酶標(biāo)儀進(jìn)行雙波長測定OD_(492)(OPD敏感波長)和OD_(630)(非敏感波長,可消除孔底指痕、污物的影響)。最終的樣品OD值為樣品OD值(OD_(492)-OD_(630))與空白孔(只加底物和終止液)的差值。 2.6人類H.hepaticus感染的ELISA血清學(xué)檢測臨界值判定 選取2008年12月至2009年3月期間在我院消化科確診的住院病人,共收集50例患者糞便標(biāo)本和血清標(biāo)本作為病例組,其中肝臟疾病10例(包括肝炎后肝硬化8例,肝癌2例),結(jié)腸癌10例,腸道潰瘍性病變10例(包括克羅恩病4例,潰瘍性結(jié)腸炎6例),十二指腸潰瘍9例,胃部疾病11例(包括單純性胃炎6例,胃癌5例);從正常人群中選取9例作為正常對照組。糞便標(biāo)本提取組織DNA后,以C255F/C255R特異性引物進(jìn)行PCR擴增,所得PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定,陽性者進(jìn)一步測序鑒定;所收集血清標(biāo)本進(jìn)行ELISA分析,結(jié)合糞便PCR結(jié)果確定cutoff值。 2.7利用ELISA血清學(xué)檢測方法初步探討人類H.hepaticus感染情況 選取2007年11月至2009年3月期間在南方醫(yī)院消化科確診的220例住院病人,其中肝臟疾病62例(包括肝炎后肝硬化33例,肝癌29例),結(jié)腸癌26例,腸道潰瘍性病變36例(包括克羅恩病15例,潰瘍性結(jié)腸炎21例),腸道感染性及增生性病變33例(包括腸炎8例,腸息肉23例,腸結(jié)核2例),十二指腸潰瘍16例,胃部疾病41例(包括單純性胃炎23例,胃癌18例),其它腫瘤5例;從正常人群中選取13例作為正常對照組。收集血清標(biāo)本進(jìn)行ELISA分析,以確定的cutoff值判定陽性與陰性結(jié)果。 2.8數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析,均數(shù)用M±SD表示,配對計數(shù)資料和多個樣本率的比較采用χ~2檢驗,顯著性水準(zhǔn)(significant level)α=0.05,P＜0.05認(rèn)為結(jié)果有顯著性差異。 結(jié)果 1、MCP原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 以肝螺桿菌全基因組DNA作為模板,通過PCR擴增獲得了約255bp的MCP基因片段,克隆至原核表達(dá)載體pET22b(+)后經(jīng)測序與GenBank數(shù)據(jù)庫公布的肝螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC51449序列完全一致(DNA測序由上海英駿公司完成),成功構(gòu)建MCP的原核表達(dá)質(zhì)粒pET22b+/MCP。 2、重組融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,含重組質(zhì)粒的大腸桿菌E.coli BL21(DE3)能夠表達(dá)相對分子質(zhì)量M:14118D的重組蛋白rhMCP,SDS-PAGE鑒定后可知rhMCP主要存在于沉淀部分,即rhMCP是以不可溶性的包涵體形式存在。經(jīng)Western blot鑒定,在約14 KD處可見一特異性條帶。 3、重組蛋白的分離純化 由于誘導(dǎo)表達(dá)的rhMCP是以不可溶的包涵體形式存在,因此用8M尿素溶解包涵體,再按變性蛋白純化方法進(jìn)行梯度尿素洗脫,其中以UrNTA200(咪唑濃度為200mM)洗脫效果最佳,純化后的rhMCP用透析袋進(jìn)行梯度尿素-PBS透析復(fù)性,復(fù)性后得到可溶性rhMCP,用BCA法測蛋白濃度為0.73mg/ml。 4、小鼠H.hepaticus感染血清學(xué)分析 以小鼠腸粘膜組織提取的基因組DNA作為模板,用肝螺桿菌特異性引物C255F/C255R進(jìn)行PCR擴增,測得陽性標(biāo)本22例,陰性標(biāo)本31例,從陽性標(biāo)本中隨機抽取5例進(jìn)行DNA測序,測序結(jié)果與GenBank公布的MCP基因序列完全一致。以rhMCP作為檢測抗原,小鼠血清作為待測樣本,進(jìn)行ELISA血清學(xué)檢測,以31例陰性標(biāo)本(以PCR檢測確定)的OD值均數(shù)+2倍標(biāo)準(zhǔn)誤(即M+2SE)作為ELISA cutoff值,則cutoff值為0.390,靈敏度為72.7%,特異度為77.4%。配對計數(shù)資料χ~2檢驗可知ELISA與PCR兩種檢測方法無顯著性差異(P=1.000,P＞0.05(雙側(cè))),且兩種診斷方法的吻合度有統(tǒng)計學(xué)意義但吻合度一般(κ=0.498,P=0.000) 5、人類H.hepaticus感染的ELISA血清學(xué)檢測臨界值判定 肝螺桿菌特異性引物C255F/C255R擴增所收集病例糞便基因組DNA,測得59例標(biāo)本中陽性者為27例,陰性者為32例,其中正常對照組中陽性者2例,陰性者7例。陽性標(biāo)本的PCR產(chǎn)物進(jìn)一步進(jìn)行DNA測序鑒定,測序結(jié)果與GenBank公布的MCP基因序列一致性達(dá)99%,僅第42位堿基發(fā)生基因缺失(PCR產(chǎn)物測序由上海英駿公司完成)。以rhMCP作為檢測抗原,人血清作為待測樣本,進(jìn)行ELISA血清學(xué)檢測,以正常對照組中7例PCR陰性標(biāo)本的ELISA OD平均值加2倍標(biāo)準(zhǔn)誤(即M+2SE)為cutoff值,則cutoff值為1.081,靈敏度為77.8%,特異度為71.9%。配對計數(shù)資料χ~2檢驗可知ELISA與PCR兩種方法在檢測Hh感染方面無顯著性差異(P=0.607,P＞0.05(雙側(cè))),且兩種診斷方法的吻合度有統(tǒng)計學(xué)意義但吻合度一般(κ=0.492,P=0.000)。 6、利用ELISA血清學(xué)檢測方法初步探討人類H.hepaticus感染情況 所收集的233例血清標(biāo)本以重組蛋白rhMCP作為檢測抗原,經(jīng)ELISA血清學(xué)檢測估計肝臟疾病組、結(jié)腸癌組、腸道潰瘍性病變組、腸道感染性及增生性病變組、十二指腸潰瘍組、胃部疾病組、其它腫瘤組Hh檢測陽性率分別為74.2%、63.0%、66.7%、57.6%、37.5%、39.0%、20.0%。χ~2檢驗可知各組ELISA Hh檢測總體陽性率有顯著性差異(χ~2=23.587,P=0.001,P＜0.05)。實驗初步發(fā)現(xiàn)患肝臟及腸道疾病的病人中Hh陽性率較高,推測在肝螺桿菌可能定植的肝臟及腸道部位所患疾病的患者中Hh ELISA血清學(xué)檢測陽性率較高。 結(jié)論 本研究通過分子克隆技術(shù),在原核表達(dá)系統(tǒng)中成功構(gòu)建MCP的原核表達(dá)質(zhì)粒pET22b+/MCP,并利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、分離純化獲得了MCP的純化重組蛋白rhMCP。以rhMCP作為檢測抗原,以糞便PCR方法做為金標(biāo)準(zhǔn),通過ELISA血清學(xué)方法檢測人血清中的特異性免疫球蛋白,初步確定肝螺桿菌ELISA血清學(xué)檢測方法的臨界值,并推測肝螺桿菌可能定植部位所患疾病Hh檢測陽性率較高,為進(jìn)一步調(diào)查我國肝螺桿菌人群感染率及探討人類肝臟疾病和腸道非特異性炎癥的病因提供實驗基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392

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本文編號：2138395