【摘要】： 研究目的：建立體外分離培養(yǎng)嗅黏膜神經(jīng)干細(xì)胞的方法,優(yōu)化嗅黏膜神經(jīng)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)條件,誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化為多巴胺能神經(jīng)元,為嗅黏膜神經(jīng)干細(xì)胞或多巴胺能神經(jīng)元移植治療帕金森病提供初步的基礎(chǔ)研究資料。建立體外分離純化嗅黏膜嗅鞘細(xì)胞的方法,從神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)角度鑒定其生物學(xué)特性,論證嗅黏膜嗅鞘細(xì)胞作為輔助細(xì)胞進(jìn)行移植治療的可能性。 研究方法：1.自成年大鼠鼻中隔活體剪取部分鼻粘膜制成細(xì)胞懸液,以含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3天后換為含生長(zhǎng)因子的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),動(dòng)態(tài)觀察原代培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程。以免疫熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞中神經(jīng)干細(xì)胞特異性分子標(biāo)記的表達(dá)。 2.應(yīng)用2%瓊脂糖懸浮培養(yǎng)傳代嗅黏膜神經(jīng)球,在免疫熒光染色法和免疫印跡的輔助下,研究傳代培養(yǎng)神經(jīng)球的生物學(xué)特性。 3.以神經(jīng)生長(zhǎng)因子、全反式維甲酸和音猬因子誘導(dǎo)嗅黏膜神經(jīng)球分化,鑒定分化細(xì)胞中酪氨酸羥化酶的表達(dá),確認(rèn)其為多巴胺能神經(jīng)元。 4.自成年大鼠鼻中隔獲取嗅黏膜,制成細(xì)胞懸液,以完全培養(yǎng)基體外培養(yǎng),三次應(yīng)用差速貼壁法純化混合細(xì)胞中的嗅鞘細(xì)胞,對(duì)嗅鞘細(xì)胞的分子標(biāo)記進(jìn)行鑒定。 5.以免疫熒光染色法和免疫印跡比較第1代和第10代嗅黏膜嗅鞘細(xì)胞中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素、神經(jīng)肽Y和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)情況。 研究結(jié)果：1.嗅黏膜混合細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶后,首先貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞大多為扁平多邊形細(xì)胞,此后可見(jiàn)散在的球形細(xì)胞貼壁。培養(yǎng)3天更換成神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基,貼壁細(xì)胞中出現(xiàn)大量的圓球形細(xì)胞,該細(xì)胞有聚集生長(zhǎng)的特點(diǎn)。大約培養(yǎng)7天后出現(xiàn)半貼壁的神經(jīng)球,呈鳥(niǎo)巢狀。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)貼壁細(xì)胞中存在較多的Nestin和CD133染色陽(yáng)性的圓形細(xì)胞,Nestin主要分布于該細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì),CD133主要分布于細(xì)胞膜,半貼壁的神經(jīng)球也陽(yáng)性表達(dá)Nestin和CD133。 2以2%瓊脂糖懸浮培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞以神經(jīng)球的方式旺盛增殖,傳代后的神經(jīng)球形態(tài)規(guī)則,大小較均勻,界限明顯。免疫熒光染色和免疫印跡均證明懸浮培養(yǎng)的第4代神經(jīng)球經(jīng)6小時(shí)快速貼壁后,仍然陽(yáng)性表達(dá)Nestin和CD133。 3使用含細(xì)胞因子的培養(yǎng)液作用貼壁的神經(jīng)干細(xì)胞24小時(shí)后,部分細(xì)胞向四周發(fā)出細(xì)長(zhǎng)的突起,突起之間相互交織成網(wǎng)。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),這些多突起細(xì)胞的胞體和細(xì)長(zhǎng)突起均含神經(jīng)絲和酪氨酸羥化酶,免疫印跡也證明了這一點(diǎn)。 4.體外擴(kuò)增經(jīng)過(guò)三次差速貼壁純化的嗅鞘細(xì)胞,可得到大量梭形雙極細(xì)胞,細(xì)胞排列規(guī)則,形態(tài)一致,呈魚(yú)群樣。免疫熒光染色顯示,第1代和第10代的嗅黏膜嗅鞘細(xì)胞均陽(yáng)性表達(dá)GFAP、S-100和p75NTR，且兩代細(xì)胞間無(wú)差異。 5.第1代嗅黏膜嗅鞘細(xì)胞與第10代嗅鞘細(xì)胞均能表達(dá)各種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素、神經(jīng)肽Y和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子,且各因子第1代的表達(dá)水平均高于第10代。 研究結(jié)論：1.通過(guò)大鼠嗅黏膜神經(jīng)干細(xì)胞的體外分離與篩選實(shí)驗(yàn),我們從嗅黏膜中獲得了陽(yáng)性表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞分子標(biāo)志的半貼壁神經(jīng)球。這些神經(jīng)球可以通過(guò)特殊的瓊脂糖懸浮培養(yǎng)法在傳代過(guò)程中得到不斷擴(kuò)增。 2.源于嗅黏膜的神經(jīng)球能夠被誘導(dǎo)分化為T(mén)H陽(yáng)性的神經(jīng)元,證明嗅黏膜來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞能夠在體外誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元。 3.以完全培養(yǎng)基體外分離培養(yǎng)嗅黏膜能獲得復(fù)雜的細(xì)胞群體,通過(guò)三次差速貼壁篩選法可以純化其中的嗅鞘細(xì)胞,經(jīng)鑒定嗅黏膜嗅鞘細(xì)胞能夠表達(dá)多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素,且能夠合成神經(jīng)肽Y和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子。 4.本實(shí)驗(yàn)成功地在體外培養(yǎng)獲得了嗅黏膜神經(jīng)干細(xì)胞和嗅鞘細(xì)胞,并將神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元,為臨床帕金森病細(xì)胞移植治療提供了新的種子細(xì)胞來(lái)源。
[Abstract]:Objective : To establish a method for the isolation and culture of olfactory mucosa neural stem cells in vitro , optimize the culture conditions of olfactory mucosa neural stem cells , induce the differentiation of neural stem cells into dopaminergic neurons , and provide preliminary basic research data for the transplantation of olfactory mucosa neural stem cells or dopaminergic neurons in the treatment of Parkinson ' s disease .


Methods : 1 . The cell suspension was made from nasal mucosa of rat nasal septum , and cultured in DMEM / F12 medium containing 10 % fetal bovine serum for 3 days . The growth process of primary cultured cells was observed dynamically . The expression of specific molecular markers of neural stem cells in cells was detected by immunofluorescence staining .


2 . Using 2 % agarose suspension to culture the olfactory mucosa neurosphere , the biological characteristics of the cultured neurospheres were studied with the aid of immunofluorescence staining and Western blot .


3 . The expression of tyrosine hydroxylase in differentiated cells was identified by the differentiation of nerve growth factor , all - trans retinoic acid ( ATRA ) and sound Hedgehog ' s factors in olfactory mucosa , and it was confirmed that it was dopaminergic neuron .


4 . The olfactory mucosa was obtained from the nasal septum of the rat . The cell suspension was prepared in vitro . The olfactory ensheathing cells in the mixed cells were purified three times by differential adherent method , and the molecular markers of olfactory ensheathing cells were identified .


5 . The expression of neurotrophin , neuropeptide Y and vascular endothelial growth factor in olfactory ensheathing cells of olfactory mucosa in the first and 10th passages were compared by immunofluorescence staining and Western blot .


The results were as follows : 1 . After inoculation of olfactory mucosa mixed cells in culture flask , most of the cells were flattened polygonal cells . After 3 days , the cells were replaced by neural stem cell culture medium . The cells were cultured for 3 days to replace them into neural stem cell culture medium .


2 % agarose suspension cultured neural stem cells proliferate in the form of neurospheres , the morphology of the neurospheres after passage is uniform and the limit is obvious . Both immunofluorescence staining and Western blot prove that the 4th generation nerve cells in suspension culture are able to express Nestin and CD133 after 6 hours .


3 . After 24 hours of using a cell containing a cytokine - containing culture solution to act on the wall , a portion of the cells sent an elongated protrusion around each other , and the protrusions were intermeshed with each other . Immunofluorescence staining showed that both the cell body and the elongated protrusion of these multiple - protruding cells contained both nerve fibers and tyrosine hydroxylase , and the Western blot demonstrated this .


4 . In vitro amplification of olfactory ensheathing cells purified by triple differential adherent cells can obtain a large number of spindle - shaped bipolar cells , the cell arrangement rules and the morphology are consistent , and are in the form of a fish group . Immunofluorescence staining shows that the olfactory mucosa olfactory ensheathing cells of the 1st and 10th passages are positive for GFAP , S - 100 and p75NTR , and there is no difference between the two generations .


5 . Both the olfactory ensheathing cells and the 10th generation olfactory ensheathing cells express various neurotrophic factors , neuropeptides Y and vascular endothelial growth factors , and the expression level of each factor in the 1st generation is higher than that of the 10th generation .


Conclusion : 1 . In vitro isolation and screening experiment of olfactory mucosa neural stem cells in rats , we obtained semi - adherent neurospheres expressing the molecular markers of positive expression neural stem cells from the olfactory mucosa . These neurospheres can be amplified by special agarose suspension culture in the passaging process .


2 . Neural stem cells derived from olfactory mucosa can be differentiated into TH - positive neurons , and the olfactory mucosa - derived neural stem cells can induce differentiation into dopaminergic neurons in vitro .


3 . In vitro isolation and culture of olfactory mucosa from culture medium to obtain complex cell population , olfactory ensheathing cells can be purified by three times differential wall screening method , and the olfactory mucosa olfactory ensheathing cells can express various neurotrophin , and neuropeptides Y and vascular endothelial growth factors can be synthesized .


4 . The olfactory mucosa neural stem cells and olfactory ensheathing cells were obtained successfully in vitro and the neural stem cells were induced into dopaminergic neurons .
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R329.28

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本文編號(hào)：2134736