【摘要】：乙型腦炎(Japanese encephalitis, JE)(簡稱乙腦)是由乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)感染引起的一種危害嚴(yán)重的人獸共患蟲媒傳染病。該病是危害我國養(yǎng)豬業(yè)的重大繁殖障礙性疫病之一。同時,它還對人類健康造成巨大威脅,是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的蟲媒病之一。但長期以來,該病的致病和免疫機(jī)理尚不太清楚,臨床中針對該病原的快速檢測方法也很缺乏。因此,開展JEV與免疫細(xì)胞的互作機(jī)制和快速檢測方法研究,對于揭示該病毒的致病與免疫機(jī)理、新型疫苗開發(fā)和臨床快速檢測具有重要科學(xué)和實踐意義。本論文主要圍繞JEV樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells, DCs)載體疫苗、JEV強(qiáng)、弱毒株與小鼠DCs互作、JEV膠體金快速檢測方法等三個方面展開研究,具體內(nèi)容如下： 1.JEV樹突狀細(xì)胞載體疫苗研究 利用滅活的JEV P3株體外刺激小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞(bmDCs),制備DC疫苗并免疫BALB/c小鼠,并于二次免疫后3周使用強(qiáng)毒攻擊。結(jié)果顯示：雖然DC疫苗免疫后誘導(dǎo)的JEV中和抗體低于滅活疫苗,但其誘導(dǎo)的IFN-γ和TNF-α水平卻顯著高于滅活疫苗,而且顯著提升抗原特異性CD8+T細(xì)胞水平。攻毒保護(hù)性試驗表明：盡管DC疫苗的保護(hù)效力略低于滅活疫苗(100%),但仍然能提供90%的保護(hù)。本研究首次表明JEV負(fù)載的DC疫苗可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高的細(xì)胞免疫水平,并能提供有效的免疫保護(hù)力,是一種具有潛在應(yīng)用前景的新型細(xì)胞疫苗。 2.JEV強(qiáng)毒株(P3株)與小鼠樹突狀細(xì)胞的相互作用研究 本研究通過探討DC感染JEV P3株后的表型功能的變化,來揭示JEV強(qiáng)毒感染與機(jī)體免疫逃逸機(jī)制之間的關(guān)系。RT-PCR、Realtime-PCR、Western blot、空斑實驗、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)、ELISpot和流式細(xì)胞檢測結(jié)果表明：JEV強(qiáng)毒株可感染DC,并可在DC中復(fù)制,JEV P3株感染不僅抑制DC的MHCⅡ、CD40、CD80和CD86等免疫共刺激分子和抗原提呈相關(guān)分子的表達(dá),顯著降低DC刺激淋巴細(xì)胞增殖和抗原提呈能力,而且還可促進(jìn)T調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化。該研究結(jié)果顯示：JEV強(qiáng)毒株感染抑制DC的成熟,并降低其抗原提呈能力,導(dǎo)致機(jī)體的免疫抑制。本研究從病毒與DC互作的角度揭示了JEV強(qiáng)毒株一種可能的免疫逃避機(jī)制,并為解析JEV強(qiáng)毒株的致病機(jī)理提供重要線索。 3.JEV疫苗株(SA14-14-2)與小鼠樹突狀細(xì)胞的相互作用研究 本研究通過研究DC感染JEV疫苗株后表型功能的變化,從而探討疫苗株接種誘導(dǎo)機(jī)體強(qiáng)大的抗病毒免疫的內(nèi)在機(jī)制。結(jié)果表明：JEV SA14-14-2株也可以感染并可在DC中復(fù)制,但是JEV SA14-14-2株感染不僅促進(jìn)DC表面的免疫共刺激分子和抗原提呈相關(guān)分子的表達(dá),而且還可顯著增強(qiáng)DC刺激淋巴細(xì)胞增殖和抗原提呈能力,抑制T調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化。說明：疫苗株可以促進(jìn)DC成熟,增強(qiáng)DC抗原提呈能力并誘導(dǎo)免疫激活。本研究首次從疫苗毒與DC互作的角度揭示了JEV疫苗株感染引發(fā)強(qiáng)大的免疫激活效應(yīng)的一種可能機(jī)制,并為揭示JEV疫苗株的免疫保護(hù)機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。 4.檢測JEV的膠體金方法的建立 本研究制備了JEV E蛋白的單克隆抗體,并利用其中兩株單克隆抗體建立了針對JEV的膠體金快速檢測方法。特異性試驗結(jié)果顯示,該方法與偽狂犬病毒(PRV)、繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)和禽流感病毒(AIV)均無交叉反應(yīng)。同時,用該方法對臨床188份送檢病料進(jìn)行檢測,結(jié)果表明：該方法與RT-PCR檢測結(jié)果的特異性和敏感性分別為99.3%和85.7%。說明：本研究建立檢測方法可以作為一種新型檢測方法用于JEV的臨床快速檢測。
[Abstract]:Japanese encephalitis ( JE ) ( JE ) ( JE ) is one of the most serious infectious diseases caused by Japanese encephalitis virus ( JEV ) infection .


1 . Study on JEV Dendritic Cell Vector Vaccine


The results showed that although the protective efficacy of DC vaccine was slightly lower than that of inactivated vaccine ( 100 % ) , the induction of IFN - 緯 and TNF - 偽 was significantly higher than that of inactivated vaccine ( 100 % ) .


Interaction between JEV virulent strain ( P3 strain ) and mouse dendritic cells


The results of RT - PCR , Realtime - PCR , Western blot , plaque assay , mixed lymphocyte reaction ( MLR ) , pot and flow cytometry showed that JEV virulent strain could infect DC , and could also promote the differentiation of T - regulated cells .


3 . Interaction of JEV Vaccine Strain ( SA14 - 14 - 2 ) with Dendritic Cells in Mice


The results showed that JEV SA14 - 14 - 2 strain can promote DC maturation , enhance DC antigen presentation ability and induce immune activation .


4 . Establishment of colloidal gold method for detection of JEV


A monoclonal antibody against JEV E protein was prepared and two monoclonal antibodies were used to establish a method for rapid detection of JEV . The results showed that the method was not cross - reactive with PRV , FMDV and Avian Influenza Virus . The results showed that the specificity and sensitivity of this method were 99 . 3 % and 85.7 % , respectively .
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392

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本文編號：2128868