【摘要】： 目的:犬小孢子菌是一種可侵犯人和動(dòng)物皮膚、毛發(fā)、甲的真菌,其突出的生物學(xué)特點(diǎn)是嗜角質(zhì)性,引起皮膚的淺部感染。它不是機(jī)會(huì)性致病菌,而是真正感染健康機(jī)體的致病菌。隨著人們生活水平的提高,貓狗等寵物與人類接觸的增加導(dǎo)致犬小孢子菌病逐年增加,特別是犬小孢子菌所致膿癬例數(shù)急劇增加。有證據(jù)顯示分泌性活性蛋白酶在它們侵入性方面扮演了重要的角色,然而除蛋白酶以外的因子與頭癬的相關(guān)性及在頭癬中的發(fā)病機(jī)制尚無報(bào)道。先期試驗(yàn)已經(jīng)從不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)出犬小孢子菌,即兒童頭皮組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基菌株(tester);兒童光滑皮膚組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基菌株(driver1);成人頭皮組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基菌株( driver2 ),利用抑制消減雜交技術(shù)( suppression subtractive hybridization ,SSH)構(gòu)建了tester與driver1(SSH1文庫)和tester與driver2(SSH2文庫)的兩個(gè)正向差異基因文庫,并進(jìn)行了文庫克隆。本實(shí)驗(yàn)就差異文庫的進(jìn)一步篩選及對(duì)獲得的差異基因進(jìn)行功能及定量分析,為下一步探討差異基因在頭癬發(fā)病機(jī)制中的作用及在豚鼠感染模型中的研究做出一些探索。 方法: 1.利用斑點(diǎn)雜交對(duì)SSH1和SSH2文庫(均為250個(gè)克隆)進(jìn)行陽性克隆篩選。 2.對(duì)篩選的陽性克隆測(cè)序并利用BLAST在GenBank和蛋白質(zhì)直系同源簇?cái)?shù)據(jù)庫(Clusters of Orthologous Groups of proteins,COG)上進(jìn)行同源序列分析。 3.利用實(shí)時(shí)PCR對(duì)差異基因進(jìn)行定量檢測(cè)。 結(jié)果: 1.斑點(diǎn)雜交后共得到110個(gè)陽性克隆。 2.陽性克隆的測(cè)序:SSH1文庫得到了62個(gè)有效序列,SSH2文庫得到了44個(gè)有效序列。數(shù)據(jù)庫的分析:去除混雜基因(與人基因同源性98%,線性分?jǐn)?shù)=200;與真菌基因線性分?jǐn)?shù)40)后,共得到13個(gè)EST,其中5個(gè)為未知新序列,可能代表了tester特異表達(dá)的新基因,8個(gè)找到了同源基因,其中6個(gè)具有功能分類。 3.實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)結(jié)果:SSH1文庫中的FSH1和PQ-LRP基因在tester RNA池中的表達(dá)量分別為driver1 RNA池中表達(dá)量的44.6倍和117倍;SSH2文庫中的P-GAL4和NADH1基因在tester RNA池中的表達(dá)量分別為driver2 RNA池中表達(dá)量的78.2倍和9.8倍。 結(jié)論: 1.在SSH1文庫中篩選到5個(gè)同源基因:FSH1、PQ-LRP、multidrug resistance protein MDR、RING zinc finger protein和RING zinc finger protein, putative。在SSH2文庫中篩選到3個(gè)同源基因:P-GAL4、NADH1和DNA-directed RNA polymerase I subunit。 2. FSH1和PQ-LRP基因在兒童頭皮組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基菌株中相對(duì)于兒童光滑皮膚組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基菌株中的上調(diào)表達(dá)表明,這2個(gè)基因在犬小孢子菌感染頭皮組織中具有重要作用,可以作為犬小孢子菌致頭癬的分子機(jī)理繼續(xù)研究。 3. P-GAL4和NADH1基因在兒童頭皮組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基菌株中相對(duì)于成人頭皮組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基菌株中的上調(diào)表達(dá)顯示,這2個(gè)基因可能與犬小孢子菌更易于感染兒童有關(guān),可以作為研究犬小孢子菌致病性的候選基因。
[Abstract]:Objective: Microsporum canis is a fungus that invades human and animal skin, hair, and armour. Its prominent biological characteristics are the horniness and the superficial infection of the skin. It is not an opportunistic pathogen, but a pathogenic bacteria that really infects the healthy body. With the improvement of people's living water, the pet and dog and other pets are in contact with humans. Microsporosis in dogs has increased year by year, especially the number of cases of psoriasis caused by Microsporum canis, and there is evidence that secretory protease plays an important role in their invasiveness. However, there is no report on the correlation between the protease except for the tinea capitis and the pathogenesis in the tinea capitis. The culture medium of canine microspore was cultured in the same inducible medium, that is, the culture medium strain (tester) of the children's scalp tissue, the culture medium strain (Driver1) of the smooth skin tissue of children, the culture medium strain (Driver2) of the adult scalp tissue, and the construction of tester with the suppression subtractive hybridization technique (suppression subtractive hybridization, SSH). Two positive differential gene libraries of Driver1 (SSH1 Library) and tester and Driver2 (SSH2 Library) were cloned. The further screening of the differential library and the functional and quantitative analysis of the differential genes were carried out in this experiment to explore the role of the differential gene in the pathogenesis of tinea pedis and the infection model of guinea pig in the next step. Research makes some explorations.
Method:
1. dot blot was used to screen positive clones of SSH1 and SSH2 libraries (all 250 clones).
2. the screened positive clones were sequenced and BLAST was used to analyze the homologous sequences on the GenBank and protein direct homologous cluster database (Clusters of Orthologous Groups of proteins, COG).
3. quantitative detection of differentially expressed genes by real-time PCR.
Result:
110 positive clones were obtained after 1. dot blot hybridization.
2. positive clones were sequenced: the SSH1 library obtained 62 effective sequences, and the SSH2 library obtained 44 effective sequences. The analysis of the database: removing the confounding gene (the homology 98%, linear fraction =200, and the linear fraction 40 of the fungal gene), 13 EST were obtained, 5 of which were unknown new sequences, which may represent a new tester specific expression. 8 of the genes found homologous genes, 6 of which have functional taxonomy.
3. the results of real-time PCR detection: the expression of FSH1 and PQ-LRP genes in the tester RNA pool is 44.6 times and 117 times in the Driver1 RNA pool, respectively. The expression of P-GAL4 and NADH1 genes in the SSH2 library is 78.2 times and 9.8 times that of the Driver1 RNA pool.
Conclusion:
1. the 5 homologous genes were screened in the SSH1 Library: FSH1, PQ-LRP, multidrug resistance protein MDR, RING zinc finger protein and RING, and 3 homologous genes were screened in the library.
The up-regulated expression of 2. FSH1 and PQ-LRP genes in the culture medium strain of children's scalp tissue induced culture medium showed that these 2 genes play an important role in the infection of the scalp tissue of Microsporum canis, which can be used as the molecular mechanism of tinea capitis caused by Microsporum canis.
The up-regulated expression of 3. P-GAL4 and NADH1 genes in the strains of adult scalp induced culture medium strains in children's scalp induced medium showed that these 2 genes may be more likely to be associated with the infection of children with Microspora canis, and can be used as a candidate gene for the study of the pathogenicity of microspore microspore.
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：2119860