本文選題：淋球菌 + 奈瑟菌表面蛋白A　； 參考：《南華大學》2009年碩士論文

【摘要】：【目的】利用已構(gòu)建的真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)/ltB、pcDNA3.1(-)/nspA及pcDNA3.1(-)/ltB-nspA,通過鼻飼途徑免疫BALB/c小鼠,觀察其在小鼠鼻粘膜細胞內(nèi)的表達,檢測其所誘發(fā)的特異性體液免疫應答(尤其是粘膜免疫應答)和細胞免疫應答水平,為研制高效的淋球菌核酸疫苗提供實驗依據(jù)。 【方法】①真核質(zhì)粒的鑒定。提取真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)/nspA、pcDNA3.1(-)/ltB、pcDNA3.1(-)/ltB-nspA行PCR及雙酶切鑒定。②觀察真核重組質(zhì)粒在小鼠鼻粘膜細胞內(nèi)的表達。真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)/ltB、pcDNA3.1(-)/nspA及pcDNA3.1(-)/ltB-nspA,通過鼻飼途徑免疫BALB/c小鼠,末次免疫后2w取小鼠鼻粘膜采用免疫組織化學法檢測NspA、LTB、LTB-NspA蛋白的表達。③nspA-ltB核酸疫苗免疫活性的檢測。取真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)/nspA、pcDNA3.1(-)/ltB-nspA鼻飼免疫BALB/c小鼠,同時設對照組pcDNA3.1(-)/ltB、pcDNA3.1(-)和PBS組,共免疫3次。每次免疫前一天及末次免疫后2w經(jīng)小鼠尾靜脈采血,分離血清,間接ELISA法檢測血清中NspA特異性IgG抗體水平;同時用PBS沖洗小鼠生殖道,收集其生殖道沖洗液,間接ELISA法檢測沖洗液中NspA特異性SIgA抗體水平。末次免疫后2w取小鼠脾淋巴細胞于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后,MTT法檢測淋巴細胞增殖水平,間接ELISA法檢測脾淋巴細胞培養(yǎng)上清IFN-γ含量。 【結(jié)果】真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)/nspA、pcDNA3.1(-)/ltB和pcDNA3.1(-)/ltB-nspA,經(jīng)鼻飼途徑免疫BALB/c小鼠,末次免疫后2w采用免疫組織化學法檢測到重組蛋白在小鼠鼻粘膜細胞內(nèi)表達;實驗組pcDNA3.1(-)/nspA、pcDNA3.1(-)/ltB-nspA小鼠生殖道沖洗液中NspA特異性SIgA水平明顯高于對照組(P0.01),且含粘膜佐劑的pcDNA3.1(-)/ltB-nspA組較單基因pcDNA3.1(-)/nspA組高(P0.05)。實驗組小鼠血清中NspA特異性IgG抗體明顯高于對照組(P0.01);但pcDNA3.1(-)/ltB-nspA組與單基因pcDNA3.1(-)nspA組比較,特異性IgG抗體水平差異不顯著(P0.05)。實驗組小鼠脾淋巴細胞經(jīng)特異性NspA抗原刺激后,培養(yǎng)上清中IFN-γ含量明顯高于對照組(P0.01) [pcDNA3.1(-)/nspA組達153.79±19.03pg/mL,pcDNA3.1(-)/ltB-nspA組達160.56±25.67pg/mL,與pcDNA3.1(-)/ ltB組(60.56±11.45pg/mL) ,空質(zhì)粒組pcDNA3.1(-) (40.34±9.89pg/mL)和PBS組(25.75±6.12pg/mL)之間有顯著性差異(P0.01),兩實驗組間IFN-γ含量差異不顯著(P0.05)。MTT法檢測脾淋巴細胞增殖水平, pcDNA3.1(-)/ltB-nspA組和pcDNA3.1(-)/nspA組小鼠脾淋巴細胞經(jīng)特異性NspA抗原刺激后,刺激指數(shù)分別為(1.653±0.32)和(1.598±0.25),明顯高于對照組[pcDNA3.1(-)/ltB組(1.122±0.21),空質(zhì)粒組pcDNA3.1(-) (1.134±0.17)和PBS組(1.014±0.10) (P0.01)],兩實驗組間刺激指數(shù)差異不顯著(P0.05)。 【結(jié)論】 1、用構(gòu)建好的pcDNA3.1(-)/nspA、pcDNA3.1(-)/ltB-nspA核酸疫苗,通過鼻飼途徑免疫BALB/c小鼠,能夠誘導小鼠產(chǎn)生較強的特異性體液免疫應答(尤其是粘膜免疫應答)和細胞免疫應答。 2、真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)/ltB、pcDNA3.1(-)/nspA及pcDNA3.1(-)/ltB-nspA,通過鼻飼途徑免疫BALB/c小鼠,能在鼻粘膜細胞內(nèi)獲得表達。 3、證實了LTB作為粘膜佐劑與NspA融合,通過鼻飼免疫后能提高NspA誘導的特異性SIgA水平。
[Abstract]:[Objective] to use the constructed eukaryotic recombinant plasmid pcDNA3.1 (-) /ltB, pcDNA3.1 (-) /nspA and pcDNA3.1 (-) /ltB-nspA to immunization BALB/c mice through nasal feeding, to observe the expression in the murine nasal mucosa cells, and to detect the specific humoral immune response (especially the mucosal immune response) and the cellular immune response. To provide an experimental basis for efficient nucleic acid vaccine of Neisseria gonorrhoeae.
(method) identification of eukaryotic plasmid. Extract eukaryotic recombinant plasmid pcDNA3.1 (-) /nspA, pcDNA3.1 (-) /ltB, pcDNA3.1 (-) /ltB-nspA PCR and double enzyme digestion. (2) observe the expression of eukaryotic recombinant plasmid in murine nasal mucosa cells. Eukaryotic recombinant plasmid pcDNA3.1 (-) / ltB, pcDNA3.1 (-) /nspA and pcDNA3.1 (-), through nasal feeding pathway exemption The immunization of NspA, LTB, LTB-NspA protein in the nasal mucosa of the infected BALB/c mice was detected by 2W after the last immunization. The immunoactivity of nspA-ltB nucleic acid vaccine was detected. The eukaryotic recombinant plasmid pcDNA3.1 (-) /nspA, pcDNA3.1 (-) /ltB-nspA nasogastric immune BALB/c mice were taken, and the control group was also set up for pcDNA3.1 (-) and group. They were immunized 3 times. After each immunization, 2W was collected from the tail vein of mice one day before and after the last immunization. Serum was isolated from the tail vein of mice. The serum level of NspA specific IgG antibody in serum was detected by indirect ELISA. Meanwhile, the reproductive tract of mice was washed with PBS, the reproductive tract irrigation fluid was collected, and the specific SIgA antibody level of NspA in the liquid was detected by indirect ELISA method. The 2W was taken after the last immunization. After the culture of rat spleen lymphocytes in 37 5%CO2 incubator, the proliferation level of lymphocytes was detected by MTT, and the IFN- gamma content in spleen supernatant was detected by indirect ELISA.
[results] the eukaryotic recombinant plasmid pcDNA3.1 (-) /nspA, pcDNA3.1 (-) /ltB and pcDNA3.1 (-) /ltB-nspA were immune to BALB/c mice through nasal feeding, and the recombinant protein was detected by immunohistochemistry in the nasal mucosa of mice after the last immunization, and the experimental group pcDNA3.1 (-) /nspA, pcDNA3.1 (-) /ltB-nspA mice reproductive tract irrigate. The level of heterosexual SIgA was significantly higher than that of the control group (P0.01), and the pcDNA3.1 (-) /ltB-nspA group containing the mucosal adjuvant was higher than that of the single gene pcDNA3.1 (-) /nspA group (P0.05). The serum NspA specific IgG antibody in the experimental group was significantly higher than that of the control group (P0.01), but the specific antibody level difference was compared with the pcDNA3.1 (-) / ltB-nspA group and the single gene (-) group It was not significant (P0.05). The content of IFN- gamma in the culture supernatant was significantly higher than that of the control group (P0.01) [pcDNA3.1 (-) /nspA group (P0.01) 153.79 + 19.03pg/mL, pcDNA3.1 (-) /ltB-nspA group 160.56 + 25.67pg/mL, pcDNA3.1 (-) / ltB group (60.56 +), and empty plasmid group (40.34 + 9.). 89pg/mL) and PBS group (25.75 + 6.12pg/mL) had significant difference (P0.01). The difference of IFN- gamma content between the two experimental groups was not significant (P0.05).MTT method to detect the proliferation of splenic lymphocyte. The stimulus index of pcDNA3.1 (-) /ltB-nspA group and pcDNA3.1 (-) /nspA group of spleen lymphocyte was (1.653 + 0.32) and (1.598) after specific NspA antigen stimulation. + 0.25), significantly higher than the control group [pcDNA3.1 (-) /ltB group (1.122 + 0.21), empty plasmid group pcDNA3.1 (-) (1.134 + 0.17) and PBS group (1.014 + 0.10) (P0.01)], two experimental group stimulation index difference was not significant (P0.05).
[Conclusion]
1, using the constructed pcDNA3.1 (-) /nspA, pcDNA3.1 (-) /ltB-nspA nucleic acid vaccine and immunization of BALB/c mice through the nasal feeding pathway, it can induce a strong specific humoral immune response (especially the mucosal immune response) and cellular immune response in mice.
2, eukaryotic recombinant plasmid pcDNA3.1 (-) /ltB, pcDNA3.1 (-) /nspA and pcDNA3.1 (-) /ltB-nspA can immunized BALB/c mice through nasal feeding, and can be expressed in nasal mucosa cells.
3, it is confirmed that LTB can be used as a mucosal adjuvant and NspA fusion. After nasal feeding immunization, the level of specific SIgA induced by NspA can be increased.
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R392

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本文編號：2113043