本文選題：風(fēng)疹病毒 + 核糖核酸　； 參考：《山東大學(xué)》2009年博士論文

【摘要】： 風(fēng)疹病毒是常見的上呼吸道感染病原體,也是常見的胎兒致畸的主要病原之一。風(fēng)疹病毒主要侵犯上呼吸道粘膜,引起上呼吸道炎癥。風(fēng)疹病毒感染最嚴(yán)重的問題是孕婦感染可導(dǎo)致對(duì)嬰兒的先天性損害,尤其前3個(gè)月感染風(fēng)疹病毒,可通過胎盤感染胎兒,導(dǎo)致孕婦流產(chǎn)、死胎,或新生兒一系列的器官畸形等先天性風(fēng)疹綜合癥。 目前,風(fēng)疹病毒實(shí)驗(yàn)室診斷越來越多地采用核酸擴(kuò)增方法來檢測(cè)臨床標(biāo)本中的風(fēng)疹病毒RNA。但是,目前使用的以RT-PCR為主的RNA病毒核酸擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒中,一般采用風(fēng)疹病毒顆粒、裸露RNA或病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA作為陽性質(zhì)控品或標(biāo)準(zhǔn)品。病毒顆粒和裸露RNA具有潛在的生物傳染性,不穩(wěn)定,易被RNase降解;cDNA不在病毒顆粒內(nèi),無法模擬臨床標(biāo)本中病毒核酸的提取及RNA逆轉(zhuǎn)錄過程,所以,風(fēng)疹病毒顆粒、裸露RNA或病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA作為標(biāo)準(zhǔn)品或質(zhì)控品,準(zhǔn)確性都不理想。因而,人們普遍關(guān)心的是病毒核酸檢測(cè)試劑盒中使用的陽性參考品和質(zhì)控品是否具有傳染性以及能否起到陽性全程監(jiān)控的作用。提出假設(shè):利用MS2噬菌體衣殼蛋白自我組裝的特性,采用原核表達(dá)技術(shù)將風(fēng)疹病毒El部分保守序列包裝到MS2噬菌體衣殼蛋白內(nèi)構(gòu)成噬菌體樣顆粒,組裝成內(nèi)含風(fēng)疹病毒El部分保守序列耐RNase的噬菌體樣顆粒,并將其作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用于風(fēng)疹病毒RNA TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法中,并對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1.建立風(fēng)疹病毒RNA TaqmMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法。 2.利用MS2噬菌體衣殼蛋白自我組裝的特性,采用原核表達(dá)技術(shù)將風(fēng)疹病毒El部分保守序列包裝到MS2噬菌體衣殼蛋白內(nèi)構(gòu)成噬菌體樣顆粒,組裝成內(nèi)含風(fēng)疹病毒El部分保守序列耐RNase的噬菌體樣顆粒。 3.將構(gòu)建的風(fēng)疹病毒RNA噬菌體樣顆粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品,應(yīng)用于所建立的風(fēng)疹病毒RNA TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法中,并對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。 實(shí)驗(yàn)第一部分: 建立風(fēng)疹病毒RNA TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法,將風(fēng)疹病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA作為RV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR陽性標(biāo)準(zhǔn)品,定量檢測(cè)已確診的風(fēng)疹患者咽拭子標(biāo)本中風(fēng)疹病毒RNA,評(píng)價(jià)其敏感度與特異度。 實(shí)驗(yàn)第二部分: 利用MS2噬菌體衣殼蛋白自我組裝的特性,采用原核表達(dá)技術(shù)將風(fēng)疹病毒El部分保守序列包裝到MS2噬菌體衣殼蛋白內(nèi)構(gòu)成噬菌體樣顆粒。即將大腸桿菌MS2噬菌體衣殼蛋白的編碼基因序列構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET30a(+)獲一重組表達(dá)載體,然后將風(fēng)疹病毒El的部分高度保守RNA序列構(gòu)建到該重組表達(dá)載體上,經(jīng)誘導(dǎo)后表達(dá)獲內(nèi)含風(fēng)疹病毒El部分保守序列的噬菌體樣顆粒,然后對(duì)內(nèi)含風(fēng)疹病毒El部分保守序列的噬菌體樣顆粒進(jìn)行定量分析,并驗(yàn)證其耐核糖核酸酶(RNase)特性,以及分析其在4℃和37℃血漿中的穩(wěn)定性,并與風(fēng)疹病毒病毒株在37℃血漿中的穩(wěn)定性進(jìn)行比較。 實(shí)驗(yàn)第三部分: 將實(shí)驗(yàn)第二部分構(gòu)建的內(nèi)含風(fēng)疹病毒El部分保守序列的噬菌體樣顆粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)第一部分所建立的風(fēng)疹病毒RNA TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法中,并定量檢測(cè)已確診的風(fēng)疹患者鼻咽拭子標(biāo)本中風(fēng)疹病毒RNA,評(píng)價(jià)其敏感度與特異度。通過對(duì)其檢測(cè)靈敏度、重復(fù)性、敏感度與特異度等指標(biāo)的測(cè)定,并與實(shí)驗(yàn)第一部分中RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)的相應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行比較,來分析實(shí)驗(yàn)第二部分構(gòu)建的內(nèi)含風(fēng)疹病毒El部分保守序列的噬菌體樣顆粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品的優(yōu)勢(shì)所在。 實(shí)驗(yàn)方法: 1.建立風(fēng)疹病毒RNA TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法,將風(fēng)疹病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA,作為RV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR陽性標(biāo)準(zhǔn)品,定量檢測(cè)已確診的風(fēng)疹患者鼻咽拭子標(biāo)本中風(fēng)疹病毒RNA,評(píng)價(jià)其敏感度與特異度。 2.利用MS2噬菌體衣殼蛋白自我組裝的特性,采用原核表達(dá)技術(shù)將風(fēng)疹病毒El部分保守序列包裝到MS2噬菌體衣殼蛋白內(nèi)構(gòu)成噬菌體樣顆粒,采用基因工程方法構(gòu)建含部分RV El、MS2衣殼蛋白及裝配蛋白編碼基因重組表達(dá)載體,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒。 3.行RT-PCR及PCR對(duì)噬菌體樣顆粒包繞的內(nèi)容物風(fēng)疹病毒RNA進(jìn)行驗(yàn)證。 4.采用風(fēng)疹病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法對(duì)含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒進(jìn)行定量分析。 5.將噬菌體樣顆粒懸浮液用TSM稀釋液分別稀釋10~7、10~8、10~9倍,對(duì)含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒每一個(gè)濃度實(shí)施RNase處理,采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法定量檢測(cè)RNase處理前后的含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒,通過比較RNase處理前后的Ct值有沒有顯著性差別,來驗(yàn)證含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒耐核糖核酸酶(RNase)特性。 6.將噬菌體樣顆粒懸浮液,置于4℃和37℃EDTA抗凝正常人血漿中,分別孵育60天和30天,來驗(yàn)證含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒在4℃及37℃血漿中的穩(wěn)定性;將含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒懸浮液與RV病毒株,分別置于37℃EDTA抗凝正常人血漿中,孵育30天,采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法定量測(cè)定收集的幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)的噬菌體樣顆粒懸浮液與RV病毒株濃度,來比較噬菌體樣顆粒與RV病毒株在37℃血漿中的穩(wěn)定性。 7.將含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒作為RV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR陽性標(biāo)準(zhǔn)品,測(cè)定其檢測(cè)靈敏度及方法的重復(fù)性,并定量檢測(cè)已確診的風(fēng)疹患者鼻咽拭子標(biāo)本中風(fēng)疹病毒RNA,確定其敏感度與特異度。 8.將含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒作為實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR陽性標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)PCR擴(kuò)增效率、方法的檢測(cè)靈敏度、重復(fù)性、方法的敏感度與特異度,與風(fēng)疹病毒逆轉(zhuǎn)錄cDNA作為實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR陽性標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)的PCR擴(kuò)增效率、方法的檢測(cè)靈敏度、重復(fù)性、方法的敏感度與特異度進(jìn)行比較。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1.成功建立了風(fēng)疹病毒RNA TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法,采用風(fēng)疹病毒逆轉(zhuǎn)錄cDNA作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品,PCR擴(kuò)增效率為1.89,方法的檢測(cè)靈敏度為1.0×10~3copies/ml,方法的重復(fù)性結(jié)果為:對(duì)六個(gè)稀釋度陽性標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)六次Ct值變異系數(shù)范圍為3.2996～4.36%。以細(xì)胞培養(yǎng)法作為金標(biāo)準(zhǔn),方法的特異度和敏感度分別為88.9%,81.3%。 2.通過部分風(fēng)疹病毒El保守序列測(cè)序驗(yàn)證,成功構(gòu)建與表達(dá)含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒。 3.將含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒懸浮液進(jìn)行10~4,10~5,10~6,10~7倍稀釋,然后以各個(gè)稀釋度為模板,分別行RT-PCR及PCR。RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果為陽性,PCR擴(kuò)增結(jié)果為陰性,表明噬菌體樣顆粒包繞的內(nèi)容物為風(fēng)疹病毒RNA,不是DNA,也不是DNA污染。 4.將含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒懸浮液進(jìn)行10~4,10~5,10~6倍稀釋,然后分別以各個(gè)稀釋度為模板,采用風(fēng)疹病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法進(jìn)行定量檢測(cè),含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒懸浮液各個(gè)稀釋度的濃度分別為2.05×10~5copies/μl,2.85×10~4 copies/μl,2.5×10~3 copies/μl。由此計(jì)算出含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒懸浮液的原始濃度為2.45×10~9copies/μl。 5.將噬菌體樣顆粒懸浮液用TSM稀釋液分別稀釋10~7、10~8、10~9倍,濃度分別為2.45×10~5 copies/mL、2.45×10~4 copies/mL、2.45×10~3 copies/mL。含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒每一個(gè)濃度,RNase處理前后實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法定量檢測(cè)Ct值沒有顯著性差別(P值均＞0.05)。表明RNase處理對(duì)含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒的濃度沒有任何影響,也就表明含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒具有耐核糖核酸酶的特性。 6.將濃度為2.45×10~4 copies/mL的噬菌體樣顆粒懸浮液,置于4℃EDTA抗凝正常人血漿中,孵育60天,收集的每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的噬菌體樣顆粒懸浮液,采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法,對(duì)每一標(biāo)本重復(fù)測(cè)定兩次,取平均值。收集的八個(gè)時(shí)間點(diǎn)的噬菌體樣顆粒懸浮液所有標(biāo)本測(cè)定值的變異系數(shù)為4.66%。表明含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒懸浮液,在4℃EDTA抗凝正常人血漿中,至少持續(xù)保持穩(wěn)定60天。 7.將濃度為2.45×10~4 copies/mL的噬菌體樣顆粒懸浮液,置于37℃EDTA抗凝正常人血漿中,孵育30天,收集的七個(gè)時(shí)間點(diǎn)的噬菌體樣顆粒懸浮液,采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法,對(duì)每一標(biāo)本重復(fù)測(cè)定兩次,取平均值。收集的七個(gè)時(shí)間點(diǎn)的噬菌體樣顆粒懸浮液所有標(biāo)本測(cè)定值的變異系數(shù)為3.46%。表明含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒懸浮液,在37℃EDTA抗凝正常人血漿中,至少持續(xù)保持穩(wěn)定30天。 8.分別將終濃度為2.45×10~3copies/μL、5.0×10~3copies/μL的噬菌體樣顆粒懸浮液與風(fēng)疹病毒株,置于37℃EDTA抗凝正常人血漿中,孵育30天,收集的每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的噬菌體樣顆粒懸浮液與風(fēng)疹病毒株,采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法,對(duì)每一標(biāo)本重復(fù)測(cè)定兩次,取平均值。收集的六個(gè)時(shí)間點(diǎn)的噬菌體樣顆粒懸浮液所有標(biāo)本,平均值為2.54×10~3copies/μl,變異系數(shù)為4.11%。表明含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒懸浮液,在37℃EDTA抗凝正常人血漿中持續(xù)保持穩(wěn)定30天。而收集的六個(gè)時(shí)間點(diǎn)的風(fēng)疹病毒株所有標(biāo)本測(cè)定的濃度范圍為1.05×10~3copies/μl～5.0×10~3copies/μl,風(fēng)疹病毒株于37℃血漿中孵育30天測(cè)得的結(jié)果(1.05×10~3copies/μl),與孵育0天所測(cè)結(jié)果(5.0×10~3copies/μl)相比,濃度下降了79%。 9.采用風(fēng)疹病毒噬菌體樣顆粒作為風(fēng)疹病毒RNA TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法的陽性標(biāo)準(zhǔn)品,PCR擴(kuò)增效率為1.97,方法的檢測(cè)靈敏度為2.45×10~2copies/ml,方法的重復(fù)性結(jié)果為:對(duì)六個(gè)稀釋度陽性標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)六次Ct值變異系數(shù)范圍為0.98%～1.03%。以細(xì)胞培養(yǎng)法作為金標(biāo)準(zhǔn),該方法的特異度和敏感度分別為98.1%,91.1%。 10.與風(fēng)疹病毒逆轉(zhuǎn)錄cDNA作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品相比,風(fēng)疹病毒噬菌體樣顆粒作為風(fēng)疹病毒RNA Taqman實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法的陽性標(biāo)準(zhǔn)品,具有同樣較高的PCR擴(kuò)增效率(p＞0.05),具有更高的檢測(cè)靈敏度(p＜0.05),具有更好的重復(fù)性(p＜0.001),具有更高的特異度(p＜0.01)和敏感度(p＜0.05)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論: 研究結(jié)果取得下列新的結(jié)論: 1.實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法快速、敏感、特異。 2.采用MS2噬菌體自我組裝技術(shù)能夠成功構(gòu)建表達(dá)含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒。 3.含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒耐核糖核酸酶。 4.含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒在血漿中穩(wěn)定性良好。 5.與逆轉(zhuǎn)錄cDNA標(biāo)準(zhǔn)品相比,采用含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒作為標(biāo)準(zhǔn)品,實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR具有同樣高的PCR擴(kuò)增效率、更高的檢測(cè)靈敏度和更好的重復(fù)性。 6.與逆轉(zhuǎn)錄cDNA標(biāo)準(zhǔn)品相比,采用含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒作為標(biāo)準(zhǔn)品,實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR具有更高的特異度與敏感度。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R373

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本文編號(hào)：2105299