本文選題：神經(jīng)氨酸酶 + 糖基化��； 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2009年碩士論文

【摘要】： 許多病毒包膜蛋白為糖蛋白,如流感病毒(Influenza Virus)的血凝素(Hemagglutinin, HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase, NA),乙肝病毒(Hepatitis B Virus,HBV)的全長preS以及人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)的gp120蛋白等。這些糖蛋白大多為病毒疫苗的主要保護性抗原。目前針對這些抗原的疫苗研究主要集中在對蛋白抗原表位或多糖抗原表位的研究上,而對糖基在糖蛋白疫苗中的作用研究較少。在許多抗原提呈細胞(Antigen Presenting Cells, APCs)上已發(fā)現(xiàn)大量的甘露糖受體,這提示甘露糖可能參與抗原的提呈。Lam等研究發(fā)現(xiàn)畢赤酵母(Pichia pastoris)表達的甘露糖基化的卵清白蛋白(Ovalbumin, OVA)比E.coli表達的非糖基化OVA具有更強的免疫原性[1]。從而提示甘露糖基化可能會增強抗原的免疫原性。 現(xiàn)有的流感疫苗主要是雞胚系統(tǒng)生產(chǎn)的,考慮到雞胚作為疫苗生產(chǎn)系統(tǒng)時的耗時性等缺點,發(fā)展基因工程疫苗是其疫苗研究的一個重要方向。流感病毒的糖蛋白NA是流感疫苗的一個主要抗原成份,利用其來開發(fā)流感基因工程疫苗是流感疫苗研究的一個重要部分。酵母菌是一個良好的疫苗生產(chǎn)平臺,已成功應(yīng)用于HBV和人乳頭瘤病毒(Human Papilloma Virus, HPV)等非糖蛋白疫苗的生產(chǎn)。但是,Martinet等研究發(fā)現(xiàn),作為一個糖蛋白,流感病毒的N2型NA在野生型畢赤酵母菌GS115中表達時發(fā)生過度糖基化修飾,糖鏈上約含有30-40個甘露糖殘基,這種糖基結(jié)構(gòu)與天然病毒來源的NA的糖基結(jié)構(gòu)差異很大,利用這種過度糖基化的NA作為疫苗免疫時,對鼠源性X47-流感病毒的致死性攻擊只有50%的保護率,而且發(fā)現(xiàn)通過點突變?nèi)笔A的部分糖基化位點以減少NA的糖含量,在一定程度上增強了NA抗原的免疫原性[2]。但是,這種點突變及糖基化位點的減少是否會導(dǎo)致NA在合成過程中的折疊錯誤進而引起的抗原表位的變化還有待研究。本研究在不改變NA的糖基化位點的前提下,通過阻斷NA在酵母中的過度糖基化合成途徑以降低NA的糖含量,進而研究糖基化程度改變對其免疫原性的影響。因此,本研究以α-1,6甘露糖轉(zhuǎn)移酶(OCH1)基因缺陷的畢赤酵母菌(命名為GJK01)作為NA的表達菌株。OCH1基因是畢赤酵母菌過度甘露糖基化形成的一個關(guān)鍵起始酶基因,它的缺失阻斷了酵母菌的過度甘露糖基化修飾,使糖基化修飾停留在低甘露糖基化水平。 為了探索不同程度糖基化修飾與抗原免疫原性之間的關(guān)系,本研究選用了野生型畢赤酵母菌GS115、OCH1缺陷畢赤酵母菌GJK01以及大腸桿菌E.coli三種能進行不同程度糖基化修飾的表達系統(tǒng)作為研究平臺。 分別構(gòu)建了酵母表達載體pPIC9-NA和大腸桿菌表達載體pET22b-NA,并轉(zhuǎn)化野生型酵母菌GS115、OCH1缺陷酵母菌GJK01以及大腸桿菌E.coli BL21(DE3)。成功獲得了含有NA基因的三種不同的重組菌株。 通過重組菌株的培養(yǎng),目的蛋白的純化,最終純化獲得了三種不同宿主菌表達的重組蛋白NA。SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn),GS115,GJK01和E.coli表達的NA的分子量分別為:75kDa,55kDa和45kDa,經(jīng)N-糖肽特異性糖苷酶PNGaseF切割之后,上述各種NA的分子量均降低到45kDa,這與通過計算NA的氨基酸序列所得的理論值45 kDa是相一致的。因此,GS115表達的NA的糖含量為40%(高糖化),GJK01表達的NA的糖含量為18%(低糖化),E.coli表達的NA的糖含量為0%(非糖化)。 將這三種糖基化程度不同的NA免疫BALB/c小鼠,并利用雞胚生產(chǎn)的,包含N1型NA的商業(yè)化流行性感冒病毒裂解疫苗作為ELISA包被抗原,來檢測不同NA誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的針對天然NA的抗體滴度。 結(jié)果顯示,1μg/只小鼠劑量免疫時,二次免疫之后,只有低糖化NA能誘導(dǎo)較高抗體滴度的產(chǎn)生,其滴度達到1:5500,而高糖化與非糖化NA幾乎不能誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生,其滴度分別僅為:1:10 (P0.01)和1:13 (P0.01)。三次免疫之后,高糖化NA誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體滴度仍然很低,只有1:20 (P0.05),非糖化NA誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體滴度稍微有所增加,達到1:630。低糖化NA三次免疫后誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平與二次免疫之后的水平相當,滴度為1:4700。 以此為基礎(chǔ),又進一步研究了用于免疫的NA抗原的劑量與其誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體滴度之間的關(guān)系。 結(jié)果顯示,二次免疫之后,隨著劑量由0.2μg增加到1μg,低糖化NA誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體滴度從1:70增加到1:5500;而高糖化NA誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體滴度僅為1:20和1:10,進一步提高劑量到3μg時,高糖化NA才能誘導(dǎo)產(chǎn)生1:6500的抗體滴度。非糖化NA組誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體滴度的變化趨勢與對應(yīng)劑量的高糖化NA組相似。 三次免疫之后,0.2μg劑量時,低糖化NA能誘導(dǎo)1:4900抗體滴度的產(chǎn)生,而高糖化NA誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體滴度值只為1:10 (P0.01)。非糖化NA組誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體滴度的變化趨勢與對應(yīng)劑量的高糖化NA組相似,都只有在劑量增加到3μg時,才能誘導(dǎo)高的抗體滴度的產(chǎn)生。當劑量達到3μg時,三種NA均能誘導(dǎo)較高抗體滴度的產(chǎn)生,分別為:高糖化NA組為1:36000,低糖化NA組為1:25000,非糖化NA組為1:7000。 以上結(jié)果顯示,不同于野生型畢赤酵母菌GS115表達的過度糖基化的NA,OCH1缺陷的畢赤酵母菌GJK01表達的NA為低糖基化修飾的糖蛋白,而且相比于高糖化或非糖化NA,該低糖化NA具有更強的誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對天然NA的特異性抗體的能力。這提示了低糖化NA有可能成為候選的基因工程流感疫苗,具有低糖化修飾的OCH1缺陷畢赤酵母菌GJK01有望成為一種新型的糖蛋白疫苗研究和開發(fā)平臺。
[Abstract]:Many virus envelope proteins are glycoproteins such as Influenza Virus Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (Neuraminidase, NA), the full length preS of the hepatitis B virus (Hepatitis B Virus, HBV), and the human immunodeficiency virus (Human). The major protective antigens of the vaccine are currently focused on the study of protein epitopes or polysaccharides epitopes, but less research on the role of glycosyl in glycoprotein vaccines. A large number of mannose receptors have been found on Antigen Presenting Cells (APCs), which is a hint. Mannose may participate in antigen presentation.Lam and other studies found that the mannose based glycosylated ovalbumin (Ovalbumin, OVA) expressed in Pichia pastoris (Pichia pastoris) has a stronger immunogenic [1]. than the non glycosylated OVA expressed in E.coli, suggesting that mannose may enhance the immunogenicity of the antigen.
The existing influenza vaccine is mainly produced by the chicken embryo system. Considering the disadvantages of the chicken embryo as the time consuming of the vaccine production system, the development of the gene engineering vaccine is an important direction of its vaccine research. The glycoprotein NA of influenza virus is a major antigen component of the influenza vaccine. An important part of the vaccine research, yeast is a good vaccine production platform and has been successfully used in the production of HBV and Human Papilloma Virus (HPV) and other non glycoprotein vaccines. However, Martinet and other studies have found that as a glycoprotein, the N2 NA of the flu virus is in the GS115 form of wild Pichia pastoris. There are about 30-40 mannose residues in the sugar chain, which differs greatly from the glycosyl structure of NA from the natural virus. When the NA is used as a vaccine, the lethal attack of the mouse derived X47- influenza virus is only 50%, and the point mutation is found through the point mutation. A partial glycosylation site missing NA to reduce the sugar content of NA, to a certain extent, enhanced the immunogenicity of the NA antigen, but whether this point mutation and the reduction of glycosylation sites will lead to the changes in the epitopes caused by the folding errors of NA in the synthesis process still remain to be studied. This study does not change the glycosylation sites of NA. On the premise of point, by blocking the excessive glycosylation pathway of NA in yeast to reduce the sugar content of NA, and then study the effect of the change of glycosylation on its immunogenicity. Therefore, the.OCH1 gene of NA, the expression strain of NA, was used as the expression strain of the strain of -1,6 mannose transferase (OCH1) gene (named GJK01) as the.OCH1 gene. A key starting enzyme gene formed by the excessive mannose formation of the mother bacteria, the deletion of which blocks the excessive mannose modification of yeast and makes the glycosylated modification stay at the level of low mannose.
In order to explore the relationship between glycosylation and immunogenicity of different degrees of glycosylation, the study selected the wild type Pichia pastoris GS115, OCH1 defective Pichia GJK01 and Escherichia coli E.coli for three different degrees of glycosylated expression system as the research platform.
Yeast expression vector pPIC9-NA and Escherichia coli expression vector pET22b-NA were constructed respectively, and wild yeast GS115, OCH1 deficient yeast GJK01 and Escherichia coli E.coli BL21 (DE3) were transformed. Three different recombinant strains containing NA gene were successfully obtained.
Through the culture of the recombinant strain and purification of the target protein, the recombinant protein NA.SDS-PAGE analysis of three different host bacteria was obtained. The molecular weight of NA expressed in GS115, GJK01 and E.coli were 75kDa, 55kDa and 45kDa respectively. After the N- glycoseptide specific glycosidase PNGaseF was cut, the above NA molecular weight was reduced to 45. KDa, which is the same as the theoretical value 45 kDa obtained by the amino acid sequence calculated by NA. Therefore, the sugar content of NA expressed by GS115 is 40% (Gao Tanghua), the content of the sugar content of NA expressed by GJK01 is 18% (low saccharification), and the content of NA in E.coli is 0% (non saccharification).
The three NA BALB/c mice were immunized with different glycosylation levels, and the commercial Inactivated Split Influenza Vaccine containing N1 NA was used as a ELISA package to detect the antibody titers of natural NA induced by different NA induced mice.
The results showed that only low saccharification NA could induce the production of high antibody titer only after two doses of immunization at 1 g/ mice, and its titer reached 1:5500, while high saccharification and non saccharification NA could hardly induce antibody production, and its titer was only 1:10 (P0.01) and 1:13 (P0.01). After three immunizations, the antibody induced by high saccharification NA was induced. The titer was still very low, only 1:20 (P0.05), the titer of the antibody induced by non saccharification NA increased slightly, and the level of antibody induced by the three immunization of 1:630. low saccharification NA was equivalent to the level after the immunization, the titer was 1:4700.
On this basis, we further studied the relationship between the dose of NA antigen used for immunization and the specific antibody titer induced by immunization.
The results showed that the antibody titer induced by low saccharification NA increased from 1:70 to 1:5500 as the dose increased from 0.2 g to 1 mu g, and the titer of antibody induced by high saccharification NA was only 1:20 and 1:10, and the high glucose NA could induce the antibody titer to produce 1:6500 when the dose to 3 mu G was further increased. Non saccharifying NA group induced resistance to produce resistance. The trend of body titer is similar to that of the high glycated NA group.
After three immunization, low saccharification NA can induce the production of 1:4900 antibody titer at 0.2 g dose, while the titer of antibody produced by high saccharification NA is only 1:10 (P0.01). The trend of antibody titer induced by non saccharifying NA group is similar to that of the high saccharification NA group corresponding to the corresponding dose, only when the dose increases to 3 u g, the high resistance can be induced. When the dose reached 3 G, three kinds of NA could induce high antibody titer, respectively: high glucose NA group was 1:36000, low saccharification NA group was 1:25000, non saccharifying NA group was 1:7000.
The above results show that, unlike the over glycosylated NA of the wild type Pichia pastoris GS115, the NA of OCH1 deficient Pichia GJK01 expressed as a low glycosylated glycoprotein, and compared to the high saccharification or non saccharifying NA, the low saccharifying NA has a stronger ability to induce mice to produce specific antibodies against natural NA. It is shown that low saccharification NA may become a candidate gene engineering influenza vaccine. The low saccharification modified OCH1 deficient Pichia GJK01 is expected to become a new research and development platform for glycoprotein vaccine.
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392

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