本文選題：前列腺素 + E2(PGE2)��； 參考：《南開大學》2010年博士論文

【摘要】：目的前列腺素E2 (Prostaglandin E2, PGE2)是一種重要的炎性因子。它通過調(diào)節(jié)細胞增殖、遷移和凋亡等生物學行為在許多疾病中發(fā)揮重要作用。在良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia, BPH)和前列腺癌(prostate cancer, PCa)組織中PGE2的濃度明顯增加,但對其作用分子機制的研究鮮有報道。BPH間質(zhì)細胞中芳香化酶和PCa上皮細胞中鈣結(jié)合蛋白S100A8的表達明顯增加。本文研究PGE2調(diào)節(jié)芳香化酶和S100A8的信號通路,為闡明PGE2在BPH和PCa中可能的作用機制提供理論和實驗依據(jù)。 第一部分PGE2在ERRα的介導下促進前列腺間質(zhì)細胞中芳香化酶的表達 方法用RT-PCR法檢測人前列腺間質(zhì)細胞系WPMY-1中PGE2受體EPs的表達；在WPMY-1中,分別添加PGE2和／或PGE2受體EP2拮抗劑AH6809和激動劑butaprost、蛋白激酶A (protein kinase A, PKA)抑制劑H89、MEK激酶抑制劑PD98059和cAMP激活劑forskolin,用Real-time RT-PCR和Western blot法檢測雌激素受體相關(guān)受體(Estrogen receptor-related receptorα, ERRa)的基因和蛋白水平的表達；用cAMP試劑盒檢測PGE2對間質(zhì)細胞中cAMP濃度的影響；添加PGE2和/或ERRα拮抗劑氯丹、轉(zhuǎn)染ERRα的siRNA或表達質(zhì)粒,用Real-time RT-PCR、Western blot和雙熒光素酶活性實驗方法檢測ERRα在PGE2調(diào)節(jié)WPMY-1細胞中芳香化酶的表達及其影響啟動子活性中的介導作用；用染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin Immunopreciptation Assay, ChIP)方法檢測PGE2對ERRα結(jié)合芳香化酶啟動子的影響；用酶聯(lián)免疫方法檢測添加PGE2聯(lián)合轉(zhuǎn)染ERRαsiRNA或表達質(zhì)粒的間質(zhì)細胞培養(yǎng)液中雌二醇的濃度。 結(jié)果WPMY-1細胞表達除EP1外的其余三種EP受體；PGE2或EP2的激動齊butaprost或cAMP激活劑forskolin能夠促進ERRαmRNA和蛋白的表達；EP2的拮抗劑AH6809和PKA抑制劑H89能夠完全拮抗PGE2對ERRα表達的上調(diào)作用,而MEK激酶抑制劑PD98059則無明顯作用；PGE2能夠以時間依賴方式促進cAMP的生成；用ERRα拮抗劑氯丹或siRNA以及用ERRα的表達質(zhì)粒能夠明顯阻斷或促進PGE2對芳香化酶基因表達和啟動子活性的上調(diào)作用；在細胞內(nèi)ERRα通過直接特異性結(jié)合芳香化酶啟動子pI.3/Ⅱ激活轉(zhuǎn)錄,而且PGE2可以加強這種促進轉(zhuǎn)錄作用；PGE2聯(lián)合轉(zhuǎn)染ERRαsiRNA或表達質(zhì)粒的間質(zhì)細胞培養(yǎng)液中雌二醇的濃度與PGE2和ERRα的水平呈正相關(guān)。 結(jié)論在前列腺間質(zhì)細胞中,PGE2在EP2介導下通過PKA信號通路促進ERRα的表達；ERRα作為轉(zhuǎn)錄因子介導了PGE2對芳香化酶表達的促進作用,進而導致間質(zhì)細胞中雌二醇濃度的增加。提示,PGE2可能在促進前列腺中雌激素的生成以及由于雌激素效應(yīng)的增加誘導前列腺間質(zhì)增生中發(fā)揮重要的作用。 第二部分PGE2在C/EBPβ的介導下促進前列腺癌上皮細胞中S100A8的表達 方法在人前列腺癌上皮細胞系PC-3中,添加PGE2和／或PGE2受體EP2拮抗劑AH6809、EP4拮抗劑AH23848、PKA抑制劑H89和cAMP激活劑forskolin,用Real-time RT-PCR和雙熒光素酶活性實驗方法檢測S100A8的表達和啟動子活性；用cAMP試劑盒檢測PGE2對PC-3細胞中cAMP濃度的影響。用Real-time RT-PCR和Western blot法檢測PGE2對C/EBPβ的基因和蛋白表達的影響；用Western blot法檢測PGE2對C/EBPβ磷酸化的影響；添加PGE2和／或轉(zhuǎn)染增強子結(jié)合蛋白β(CCAAT/Enhancer binding proteinβ, C/EBPβ)的siRNA或表達質(zhì)粒,用Real-time RT-PCR和雙熒光素酶活性實驗方法檢測C/EBPβ在PGE2調(diào)節(jié)PC-3細胞中S100A8表達及其影響啟動子活性中的介導作用。用免疫組化染色法檢測前列腺癌組織的連續(xù)切片中環(huán)氧合酶2 (Cyclooxygenase-2, COX-2)和S100A8的表達及定位情況。 結(jié)果PGE2能夠以時間和濃度依賴的方式促進PC-3細胞中S100A8基因的表達和cAMP的生成；EP2的拮抗劑AH6809、EP4的拮抗劑AH23848和PKA抑制劑H89能夠拮抗PGE2對S100A8表達和啟動子活性的上調(diào)作用；cAMP激活劑forskolin亦可以促進S100A8的表達和啟動子的活性。PGE2能夠以時間依賴的方式促進C/EBPβ基因和蛋白的表達及其磷酸化水平；C/EBPβ的siRNA能夠明顯阻斷PGE2對S100A8基因表達和啟動子活性的上調(diào)作用；C/EBPβ的表達質(zhì)粒能夠明顯促進S100A8的表達和啟動子的活性。在同一前列腺組織切片中,COX-2和S100A8在正常腺體部分的上皮細胞呈陰性染色,而癌腺體上皮細胞呈明顯陽性染色。 結(jié)論在前列腺癌上皮細胞中,PGE2在EP2和EP4受體的介導下通過PKA信號通路促進S100A8的表達；PGE2亦能夠促進C/EBPβ的表達和轉(zhuǎn)錄活性；C/EBPβ作為轉(zhuǎn)錄因子介導了PGE2對S100A8表達的促進作用。提示,PGE2可能通過上調(diào)鈣結(jié)合蛋白S100A8在前列腺癌中發(fā)揮重要的作用。
[Abstract]:Objective To study the role of PGE2 in benign prostatic hyperplasia ( BPH ) and prostate cancer ( PCa ) .


The first part PGE2 promotes the expression of aromatic enzymes in prostate stromal cells mediated by ERR 偽


Methods The expression of PGE2 receptor EPs in human prostatic stromal cell line WPMY - 1 was detected by RT - PCR .
In WPMY - 1 , we add PGE2 and / or PGE2 receptor EP2 antagonist , AH6809 and agonist , H89 , MEK kinase inhibitor PD98059 and cAMP activator forskolin respectively , and detect the gene and protein level of estrogen receptor - related receptor 偽 ( ERRa ) by Real - time RT - PCR and Western blot .
The effect of PGE2 on cAMP concentration in interstitial cells was determined by cAMP kit .
Addition of PGE2 and / or ERR 偽 antagonist chlordane , transfection of ER偽 siRNA or expression plasmid , real - time RT - PCR , Western blot and dual luciferase activity assay were used to detect the expression of the aromatic enzyme in the WPMY - 1 cell and its effect on promoter activity .
The effect of PGE2 on the promoter of ER偽 - binding aromatic enzyme was determined by the method of chromatin immunoptation assay ( ChIP ) .
The concentration of estradiol in the interstitial cell culture solution supplemented with PGE2 co - transfected with the ERR - siRNA or the expression plasmid was detected by an enzyme - linked immunosorbent assay .


Results WPMY - 1 cells expressed the remaining three EP receptors except EP1 ;
The agonist of PGE2 or EP2 or cAMP activator forskolin can promote the expression of ER偽 mRNA and protein .
The antagonist of EP2 , AH6809 and H89 , can inhibit the up - regulation of PGE2 on the expression of ER偽 , while MEK kinase inhibitor PD98059 has no obvious effect .
PGE2 can promote the production of cAMP in a time - dependent manner ;
using the ERR alpha antagonist chlordane or siRNA and the expression plasmid with ERR . alpha . can obviously block or promote the up - regulation effect of PGE2 on the expression of the aromatic enzyme gene and the promoter activity ;
in that intracellular ERR . alpha . , transcription is activate by direct specific binding of the p.3 / 鈪，

本文編號：2099385