本文選題：HCMV + MBL　； 參考：《浙江大學》2010年博士論文

【摘要】： 研究背景： 人巨細胞病毒(HCMV)屬皰疹病毒,有脂質(zhì)包膜,229kb的雙鏈DNA,通過直接接觸傳播。HCMV感染常見于宮內(nèi)、嬰幼兒、器官移植、骨髓移植、免疫抑制或缺陷和艾滋病患者,在免疫力正常人群中也有造成致死感染的報道。由于HCMV產(chǎn)生的病毒因子能使其能逃逸宿主免疫,侵入靶細胞后造成產(chǎn)毒型、潛伏型、細胞轉(zhuǎn)化和不全感染。目前治療HCMV感染的藥物都是在HCMV進入靶細胞后才發(fā)揮作用,無法徹底清除病毒。目前缺乏針對HCMV侵入靶細胞前,即在與靶細胞膜黏附、結(jié)合或融合等環(huán)節(jié)起阻斷作用的藥物。本研究純化天然MBL(hMBL),研制和純化重組人野生型MBL(rhMBL),從人外周血單個核細胞衍生出DC (monocyte-derived dendritic cell, MD-DC);研究hMBL/rrhMBL阻遏HCMV感染MD-DC,和阻遏MD-DC將捕獲的HCMV呈遞給T細胞的功能,并初步探討其機制。為明確MBL阻斷HCMV感染的作用和機制,為MBL應用于HCMV感染的治療與預防奠定基礎。 材料與方法 1.建立rhMBL的CHO細胞株構(gòu)建rhMBL的PIRES2-AcGFP表達載體,參照Ohtani et al方法并加以改進。用上述載體轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細胞株(Chinese hamster ovary cells, CHO),按Transfast說明書配制轉(zhuǎn)染試劑并進行轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的CHO細胞,用G418篩選抗性細胞即穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞,RT-PCR分析穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株MBL基因的表達,ELISA檢測MBL蛋白。 2.hMBL/rhMBL的獲得、純化、鑒定和定量CHO/MBL細胞在含20%小牛血清的MEDM培養(yǎng)液中,37℃,5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。取培養(yǎng)上清和人新鮮血漿進行甘露聚糖-Sepharose 4B親和層析純化。SDS-PAGE鑒定純度,考馬斯量藍進行蛋白定量。 3. MD-DC和T細胞培養(yǎng)通過淋巴細胞分離液分離濃縮外周血單個核細胞,貼壁2小時后除去未貼壁的細胞。在rhGM-CSF(終濃度20 ng/ml)和rhIL-4(終濃度10ngIU/ml)含10%小牛血清的RPMI1640中培養(yǎng)。第3天半量換液,收集培養(yǎng)6天處于未成熟狀態(tài)的MD-DC,參考Svane IM報道方法,經(jīng)倒置相差顯微鏡觀察形態(tài)和流式檢測DC-SIGN分子表達率；5μg/ml植物凝集素A(PHA)刺激人外周血單個核細胞,衍生為人活化T細胞。 4.免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察MBL阻滯MD-DC捕獲HCMV功能用PKH26(紅色熒光)標記HCMV,洗滌4次除去未結(jié)合的PKH26,取2×107 (DNA拷貝數(shù))染色后的HCMV感染與MBL孵育半小時后的5×105MD-DC,反應終體積為1ml, PBS洗滌4次除去未結(jié)合的HCMV,用CD209-FITC(綠色)標記MD-DC表面DC-SIGN分子。對照組的MD-DC未經(jīng)MBL孵育。離心取沉淀做成載薄片。采用免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察MBL處理前后DC-SIGN對HCMV的捕獲情況,并拍照。 5. MBL阻遏MD-DC捕獲HCMV功能在48孔板中,每試驗孔加5×105MD-DC,分別加hMBL/rhMBL到終濃度1μg/ml,5μg/ml,10μg/ml,加完全培養(yǎng)基在37℃,5%CO2孵箱中孵育半小時。每試驗孔加2×107(DNA拷貝數(shù))HCMV,反應終體積為1ml,孵育2小時后PBS洗滌4次,徹底除去未與MD-DC結(jié)合的HCMV。熒光定量PCR檢測MD-DC捕獲HCMV的DNA拷貝數(shù)。試驗分7組,分別為對照組“MD-DC+HCMV”,實驗組“MD-DC+hMBL(1μg)+ HCMV”組、“MD-DC+hMBL(5μg)+HCMV”組、“MD-DC+hMBL(10μg)+ HCMV”組、“MD-DC+rhMBL(1μg/ml)+HCMV'’組、‘“MD-DC+rhMBL(5μg/ml) +HCMV'’組和“MD-DC+rhMBL(10μg/ml)+HCMV”組。 6. MD-DC呈遞HCMV給T細胞的功能在48孔板中,取MD-DC(2.5×105)加入HCMV(2×107DNA拷貝數(shù)),孵育半小時后,4次PBS沖洗,除去未結(jié)合的HCMV,與加入PHA刺激活化后的2.5×105T細胞,用完全培養(yǎng)基在37℃,5%CO2孵箱中培養(yǎng),分別于第3天、4天取培養(yǎng)上清用RT-PCR檢測HCMV的DNA的量,每孔做5個復孔,每孔終體積為1ml,對照組不加T細胞。 7. MBL阻遏MD-DC呈遞HCMV給T細胞的功能在48孔板中,經(jīng)方法5處理的MD-DC(2.5×105)與加入PHA刺激活化后的2.5×105T細胞,用完全培養(yǎng)基在37℃,5%CO2孵箱中培養(yǎng),分別于第3天、4天取上清用RT-PCR檢測HCMV的DNA的量,每孔做5個復孔,每孔終體積為1ml,對照組不加MBL。 8.采用CD4+免疫磁株分選法分離出CD4+T細胞,按試劑盒操作說明進行。 9.CD209單抗和CD206單抗阻滯MD-DC呈遞HCMV功能試驗 取新收獲的克隆增長的MD-DC和PHA刺激活化的T細胞,在含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液中,37℃,5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng),取存活率達95%以上的細胞用于實驗。試驗在48孔板中進行,取MD-DC(2.5×108／每孔)分別與未被熒光標記的10μg CD209單抗和10μg CD206單抗[抗甘露聚糖受體(mannan receptor MR)抗體]在37℃孵育15分鐘。加入HCMV(2×107DNA拷貝數(shù)／每孔),37℃孵育2小時后,4次PBS沖洗,除去未結(jié)合的HCMV,與PHA刺激活化后的2.5×105T細胞,用完全培養(yǎng)基在37℃,5%CO2孵箱中共同培養(yǎng),每孔終體積為1ml,每組做5個復孔,對照組不加抗體。試驗分以下3組： (1)HCMV組(對照組)：MD-DC+HCMV+T細胞 (2)CD206組：MD-DC+CD206+HCMV+T細胞 (3)CD209組：MD-DC+CD209+HCMV+T細胞 分別于第3天、4天取培養(yǎng)上清用RT-PCR檢測HCMV的DNA的量；培養(yǎng)上清中HCMV DNA量的百分數(shù)(%)=培養(yǎng)上清中HCMV DNA量／初始加入的HCMV DNA量(2×107)×100。 10.PP65+GAM-FITC單色流式細胞術檢測細胞內(nèi)HCMV-PP65的量,參照試劑盒說明書進行。 11.統(tǒng)計學處理全部數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理。數(shù)據(jù)以均值±標準差(X±SD)表示,采用單向方差分析,P≤0.05有顯著統(tǒng)計學意義。 結(jié)果： 1.通過RT-Q-PCR技術檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞目的基因表達效果 基因的表達量F=2的—△△ct次方 △△ct=(待測樣品的目的基因的ct的平均—待測樣本的看家基因的ct的平均)—(對照樣品的目的基因的ct的平均—對照樣本的看家基因的ct的平均),備注：2-△△ct值越大,說明該基因的表達量越高； 3.5引物 F (bp514):5'-GGAGCCATTCAGAATCTCATCA-3' R (bp652C):5'-AACCAGCATTGTTGGGTTCA-3' 篩選得到2種穩(wěn)定細胞株,在轉(zhuǎn)染野生型表達質(zhì)粒的細胞株中目的基因表達是轉(zhuǎn)染空載體細胞株的103倍以上。 2.獲得大量高純度的hMBL/rhMBL 從200ml人血漿中純化出320mg高純度的MBL,在1000ml的CHO/MBL培養(yǎng)上清中,能純化到510mg,經(jīng)SDS-PAGE鑒定,經(jīng)SDS還原后的MBL單體的分子量為26KD,MBL經(jīng)SDS還原成單體跑膠未見明顯的雜蛋白條帶,提示純度高。 3. MD-DC和活化T細胞的培養(yǎng) 外周血單個核細胞GM-CSF和IL-4刺激后,第6天用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)：可見細胞集落樣生長,折光性強,細胞不規(guī)則,有偽足。用CD209-FITC單色流式細胞儀檢測MD-DC百分數(shù)穩(wěn)定表達在85%以上。 4.免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察MBL阻滯MD-DC捕獲MCV的功能 MD-DC捕獲了經(jīng)PKH26(紅色熒光)標記的HCMV感染后,用CD209-FITC(綠色)標記NID-DC表面的DC-SIGN分子,然后采用免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察MBL處理前后DC-SIGN對HCMV的捕獲情況�？梢娢唇�(jīng)MBL孵育的MD-DC捕獲HCMV的量較多,而經(jīng)hMBL和rhMBL孵育后的MD-DC捕獲的HCMV的量明顯減少。表明10μg/ml濃度的hMBL/rhMBL具有明顯的阻遏作用。 5.hMBL/rhMBL阻遏MD-DC捕獲HCMV功能 為探索MBL阻遏MD-DC捕獲HCMV的功能,MD-DC暴露于不同濃度和不同類型的MBL孵育半小時后,再與HCMV37℃孵育2小時后,MD-DC經(jīng)4次PBS洗滌徹底除去未被捕獲的HCMV,熒光定量PCR檢測MD-DC內(nèi)的HCMVDNA的拷貝數(shù)。這代表了被MD-DC捕獲的HCMV DNA的量。與初始加入的HCMV DNA量為對照,捕獲的HCMV DNA量的百分數(shù)(%)=捕獲的HCMVDNA量／初始加入的HCMV DNA量×100。與未經(jīng)MBL孵育過的MD-DC所捕獲的HCMV DNA量對照,捕獲的HCMV DNA量的百分數(shù)(%)=MBL孵育后MD-DC捕獲的HCMV DNA量／未經(jīng)MBL孵育的MD-DC捕獲的HCMV DNA量×100。 經(jīng)統(tǒng)計分析,與不加MBL的組對照,1μg/ml的hMBL組和1μg/ml rhMBL組均沒有顯著意義(P=0.207,95%CI:-0.0935-0.4135;P=0.117,95%CI:-0.0535-0.4535),而5μg/ml和10μg/ml的hMBL組,5μg/ml和10μg/ml rhMBL組與對照組相比均具有顯著的差異(P=0.005,95%CI:0.1265-0.6335;P= 0.003, 95%CI:0.1465-0.6535; P=0.015,95%CI:0.0665-0.5735;P=0.007,95%CI:0.1065-0.6135)。隨著MBL劑量從1μg/ml增加到10μg/ml,MD-DC捕獲CMV的DNA量百分數(shù)均值有下降趨勢,但統(tǒng)計學分析,組間均沒有統(tǒng)計學差異(P0.05)。 與未經(jīng)MBL孵育的MD-DC的捕獲功能相對照,hMBL和rhMBL阻遏MD-DC捕獲CMV DNA量(2×107／ml)百分數(shù)的IC 50分別為4.5μg/ml和7.4μg/ml。 6. MD-DC呈遞HCMV給T細胞的功能 因為MD-DC能捕獲和傳遞HCMV給允許細胞,我們想探明DC-SIGN能否將低敏感的T細胞變得對HCMV易感。 培養(yǎng)上清中的HCMV DNA量的百分數(shù)(%)=培養(yǎng)上清中HCMV DNA量/初始加入的HCMV DNA量(2×107)×100。結(jié)果表明,第3天和第4天試驗組“MD-DC+HCMV+T”組培養(yǎng)上清中HCMV DNA的量較對照組“MD-DC+HCMV”組明顯升高,有統(tǒng)計學意義(F=46.398, P=0.000; F=16.702, P=0.004)。提示有大量的HCMV在T細胞內(nèi)增值復制。 7. hMBL/rhMBL阻遏MD-DC的HCMV傳遞功能 因為MD-DC能捕獲和傳遞HCMV給T細胞,我們想探明MBL能否阻遏HCMV從MD-DC傳遞給T細胞。 與不加MBL的組相對照,共培養(yǎng)第3天,hMBL/rhMBL的阻遏MD-DC的HCMV傳遞功能IC50分別為4.7μg/ml和3.1μg/ml:共培養(yǎng)第4天,hMBL/rhMBL的阻遏MD-DC的HCMV傳遞功能IC50分別為4.6μg/ml和2.1μg/ml。證實hMBL/rhMBL孵育后的MD-DC呈遞HCMV DNA的量顯著下降,并具有劑量依賴的阻遏作用。 不同劑量的hMBL/rhMBL阻遏MD-DC的HCMV傳遞結(jié)果,經(jīng)統(tǒng)計分析,各試驗組分別在第3天和第4天,與不加MBL的組對照,1μg/ml rhMBL組均沒有顯著意義(P=0.220,95%CI:-5.2627-1.2627;P=0.199,95%CI:-1.5327-7.0527); 1μg/ml,5μg/ml和10μg/ml的hMBL組和5μg/ml和10μg/ml的rhMBL組與對照組相比,均具有顯著性差異(P0.005),而5μg/ml和10μg/ml的hMBL組間沒有統(tǒng)計學差異(P=0.085,95%CI:-0.4227-6.1027;P=0.236,95%CI:-1.7527-6.8327), 5μg/ml和10μg/ml的rhMBL組間也沒有統(tǒng)計學差異(P=0.211,95%CI:-5.3027-1.2227; P=0.857,95%CI:-3.9127-4.6727). 在共培養(yǎng)第4天,同組的5個孔MD-DC和T細胞被收集到1管,共7管,經(jīng)免疫磁株陽性分選法分選出CD4+T細胞,CD3-APC單色流式細胞術檢測分選前后T細胞的百分數(shù)從48％～55%上升到93%～99%;PP65-GAM-FITC流式細胞術檢測T細胞內(nèi)各組HCMV PP65蛋白量從35.4%～%17.9不等,和熒光定量PCR法檢測T細胞內(nèi)各組HCMV DNA的量從28×103／ml-5.9×103／ml不等。表明MD-DC確實將其捕獲的HCMV傳遞給T細胞,并且HCMV在T細胞內(nèi)能增值。 結(jié)論： 1.成功建立分泌rhMBL細胞株(CHO/rhMBL),獲得高純度的rhMBL和hMBL; 2.成功從人外周血單個核細胞衍生出高表達DC-SIGN的MD-DC; 3.MD-DC具有捕獲HCMV并將其呈遞給T細胞的功能； 4.rhMB和LhMBL均能阻遏MD-DC對HCMV的捕獲和呈遞功能,但rhMBL效果較hMBL略差； 5.MD-DC捕獲HCMV并將其呈遞給T細胞的功能是通過DC-SIGN分子實現(xiàn)的。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392

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7 董U

本文編號：2091429