本文選題：輻照致弱尾蚴 + 日本血吸蟲　； 參考：《蘇州大學(xué)》2010年博士論文

【摘要】：血吸蟲病是世界上威脅著約2億人口健康的一大重要寄生蟲病。盡管化療在我國實施過程中起到了很好作用,卻面臨著再感染及抗藥性等問題。研制發(fā)展血吸蟲病疫苗是理想的防治方法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用,有關(guān)血吸蟲病疫苗候選抗原的研究有了重大進展,其中WHO所挑選的六種抗原即Sm97、GST、rIrVs、Sm23、TPI和Sm14已在指定獨立實驗室的深入研究發(fā)現(xiàn)這6種最具希望的血吸蟲候選抗原分子,在小鼠均不能穩(wěn)定獲得40%以上的保護力,因而這些抗原可能并不是合適的疫苗分子。 血吸蟲病疫苗發(fā)展的另一條替代途徑和策略是誘導(dǎo)自然感染狀態(tài)下并不正常出現(xiàn)的免疫應(yīng)答,以期產(chǎn)生高水平的保護力。研究表明,致弱血吸蟲尾蚴疫苗是所有用于研究血吸蟲疫苗中保護力最強的,而致弱尾蚴是在入侵早期即局部皮膚、皮膚淋巴結(jié)和肺部引起免疫應(yīng)答強有力的刺激因子并誘導(dǎo)了保護性免疫。一般認為,在血吸蟲感染人體的整個過程中,宿主免疫應(yīng)答發(fā)展至少經(jīng)歷3個變化的時相,于感染后最初的3～5周,宿主暴露在移行中的未成熟童蟲刺激中,呈現(xiàn)Th1優(yōu)勢應(yīng)答,至第5～6周,當成蟲開始產(chǎn)卵時,Th1應(yīng)答降低,并呈現(xiàn)Th2優(yōu)勢應(yīng)答,在隨后感染進入慢性期,Th2應(yīng)答受到明顯調(diào)節(jié);輻照致弱尾蚴進入體內(nèi)后,不能發(fā)育為成蟲并產(chǎn)卵,在此過程中,致弱尾蚴蟲體的形態(tài)結(jié)構(gòu)、發(fā)育、生物學(xué)行為(移行速度)以及抗原成分與正常尾蚴相比,均發(fā)生明顯的改變:尾蚴口腹吸盤腫脹;體部收縮;尾端呈皺褶狀變化;神經(jīng)肌肉的協(xié)調(diào)性破壞,在皮下滯留的時間延長,其體內(nèi)的移行被“截”短,一部分停留在皮膚,其余的最遠可移行至肺。致弱尾蚴在移行至主要免疫系統(tǒng)之前,例如脾、胸腺等前需要在體內(nèi)移行一段距離,其保護性反應(yīng)主要從皮膚、引流淋巴結(jié)到肺引起的各種效應(yīng)反應(yīng)的綜合結(jié)果,這三個部位引起的多方面免疫反應(yīng),包括從Th1有關(guān)的細胞調(diào)節(jié)活動到Th2涉及的抗體應(yīng)答對保護力至關(guān)重要。加大輻照劑量后致使僅局限皮膚期移行的致弱尾蚴并不能有效的誘導(dǎo)免疫保護作用,故致弱童蟲在肺期的移行對誘導(dǎo)有效的免疫效顯得更為重要。最近研究比較UV輻照致弱曼氏血吸蟲尾蚴與Sm23(曼氏血吸蟲膜蛋白)誘導(dǎo)小鼠(C57BL/6)產(chǎn)生的保護力及其免疫應(yīng)答的異同,兩組的保護力分別為60%和45%,明顯的不同出現(xiàn)在肺期炎癥應(yīng)答,致弱尾蚴免疫組肺期炎癥反應(yīng)明顯,單核細胞聚集在炎癥灶附近,并與移行的童蟲相關(guān)。以上結(jié)果亦顯示,肺可能是產(chǎn)生高保護性免疫應(yīng)答的重要部位。 樹突狀細胞(Dentric cell, DC)是目前已知的功能最強的抗原遞呈細胞(antigen presenting cell,APC),在先天性、獲得性免疫間起著較好的橋梁作用。CD11c分子是分子量150kD的αX亞單位β2整合素家族成員,是目前被廣泛應(yīng)用的樹突狀細胞的特異性標記物,也是是DC成熟重要的表面標記之一,其表達強度能部分代表局部組織中DC的聚集。T細胞是免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié),針對非己物質(zhì)的排異反應(yīng)強度主要由其所引發(fā)的機體免疫系統(tǒng)激活程度決定。T細胞活化程度是判別機體免疫功能狀態(tài)的重要指標。CD25分子量gp55kD,又名IL-2Rα,組成高親和力IL-2受體,促進T細胞的生長,是活化T細胞表達的重要標志性分子,檢測該分子表達則可反映T細胞活化情況[7]。本研究在建立紫外線輻照致弱日本血吸蟲尾蚴免疫BALB/c小鼠模型基礎(chǔ)上,著眼于免疫小鼠早期免疫應(yīng)答階段——致弱尾蚴感染小鼠后在肺部滯留引起的免疫病理改變及其誘導(dǎo)可能免疫保護機制研究,對脾、肺組織細胞樹突狀細胞表面分子CD11c的表達與T細胞激活程度等應(yīng)答特征分析,研究對致弱尾蚴免疫小鼠模型中起決定性作用的肺期童蟲誘導(dǎo)的肺組織免疫病理反應(yīng)及其所誘導(dǎo)的T細胞在脾等免疫器官與外周血中免疫應(yīng)答特征。此外,本實驗延長觀察時間到致弱尾蚴免疫小鼠攻擊感染6～8w后肝肉芽腫形成期CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg細胞在正常感染小鼠和免疫后攻擊感染小鼠中表達差異,分析其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答特征及其可能機制,從而對目前公認可誘導(dǎo)最高免疫保護作用疫苗——輻照致弱尾蚴誘導(dǎo)免疫應(yīng)答規(guī)律,為血吸蟲病防治提供借鑒。 第一部分紫外線致弱日本血吸蟲尾蚴誘導(dǎo)BALB /c小鼠免疫保護作用研究 【目的】建立紫外線(UV)致弱日本血吸蟲尾蚴免疫BALB/c小鼠動物模型,測定BALB/c小鼠作為輻照致弱日本血吸蟲尾蚴免疫模型的免疫保護力。 【方法】經(jīng)腹部皮膚用UV輻照致弱日本血吸蟲尾蚴連續(xù)三次免疫BALB/c小鼠,每次間隔4周,末次免疫后3周用正常尾蚴進行攻擊感染,同時設(shè)正常感染對照組。攻擊感染6周后解剖小鼠,計算減蟲率、減卵率,并觀察蟲體發(fā)育情況和肝組織肉芽腫及其細胞免疫應(yīng)答情況。 【結(jié)果】免疫組的減蟲率和減卵率分別為37.90 %和51.16 %;免疫組小鼠體內(nèi)蟲體發(fā)育明顯滯后于正常感染對照組內(nèi)蟲體;免疫組小鼠肝臟蟲卵肉芽腫較正常組明顯減少。 【結(jié)論】UV致弱日本血吸蟲尾蚴多次經(jīng)皮膚免疫BALB/c小鼠能誘導(dǎo)較高的免疫保護力,免疫組與正常感染組相比減蟲率和減卵率分別為37.90 %和51.16 %,BALB/c小鼠可作為致弱日本血吸蟲尾蚴免疫小動物模型,而其免疫保護機制有待進一步研究。 第二部分紫外線致弱日本血吸蟲尾蚴感染小鼠引起的肺組織細胞反應(yīng)及蟲體掃描電鏡觀察 【目的】通過觀察紫外線(Ultraviolet,UV)輻照致弱日本血吸蟲( Schistosoma japonicum , Sj )尾蚴感染小鼠后皮膚、肺組織細胞反應(yīng)以及肺期蟲體的受損情況,探尋輻照致弱日本血吸蟲尾蚴在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)免疫病理反應(yīng)和Sj受損情況。 【方法】掃描電鏡觀察UV致弱日本血吸蟲尾蚴與正常尾蚴并以UV致弱S j尾蚴經(jīng)腹部皮膚感染小鼠4、7、14和21天后剖殺,分別取肺組織固定、切片,光鏡下觀察蟲體周圍的組織細胞反應(yīng),并與同時期的感染小鼠組織切片進行比較,同時對小鼠體內(nèi)肺期Sj童蟲進行掃描電鏡觀察。 【結(jié)果】掃描電鏡觀察輻照致弱尾蚴與正常尾蚴相比蟲體略有收縮,存在口腹吸盤腫脹現(xiàn)象,尾叉部分卷曲;輻照致弱尾蚴感染后4～7天,小鼠肺期童蟲蟲體周圍出現(xiàn)較明顯的出血灶和炎癥反應(yīng),并有一定量的嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞的浸潤,同時期的正常感染小鼠組織內(nèi)蟲體周圍炎癥反應(yīng)卻不明顯;蟲體體壁可見不同程度的損傷,電鏡觀察顯示小鼠體內(nèi)的肺期童蟲存在明顯的畸形和發(fā)育延遲。 【結(jié)論】掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)紫外線輻照致弱尾蚴與正常尾蚴形態(tài)略有差異,將此兩組尾蚴分別感染小鼠后致弱組肺期童蟲在小鼠體內(nèi)不能正常發(fā)育成熟,紫外線減毒尾蚴發(fā)育而來的致弱肺期童蟲變化可能與減毒尾蚴誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)有關(guān)而并非完全是輻照的直接損傷;致弱尾蚴在肺期滯留時間較長,引起的病理損害主要表現(xiàn)為在肺部彌漫性出血灶、炎癥細胞浸潤、嗜酸性膿腫形成等肺期病理改變,肺部的病理改變的可能與該致弱尾蚴免疫小鼠誘導(dǎo)高免疫保護作用機制有關(guān)。 第三部分紫外線致弱致弱日本血吸蟲尾蚴免疫BALB/c小鼠血清IgG水平動態(tài)及其被動轉(zhuǎn)移保護力研究 【目的】動態(tài)觀察致弱尾蚴免疫BALB/c小鼠血清中的IgG抗體水平及其被動轉(zhuǎn)移至同種小鼠后攻擊感染后可獲得的免疫保護力,檢測輻照致弱尾蚴多次免疫接種后是否可以誘導(dǎo)體液免疫及其免疫保護作用。 【方法】采用用紫外線減毒日本血吸蟲尾蚴免疫3次,免疫間隔4周免疫BALB/c小鼠,末次免疫后每周收集小鼠血清至第10周并動態(tài)觀察致弱尾蚴免疫組BALB/c小鼠血清中的IgG抗體水平并將此在不同時間點收集血清被動轉(zhuǎn)移至另一組BALB/c小鼠體內(nèi),觀察被動免疫小鼠減蟲率和減卵率以評價被動免疫保護作用。 【結(jié)果】結(jié)果顯示輻照致弱尾蚴免疫組小鼠第6周時IgG抗體水平達到峰值且明顯高于同期的正常感染組;致弱日本血吸蟲尾蚴免疫小鼠血清在攻擊感染前被動轉(zhuǎn)移可激起小鼠較高的免疫保護力(55%)。 【結(jié)論】輻照致弱尾蚴多次免疫接種BALB/c小鼠血清被動轉(zhuǎn)移同種小鼠可誘導(dǎo)較高的免疫保護作用,提示體液免疫在輻照致弱日本血吸蟲尾蚴誘導(dǎo)免疫保護機制中發(fā)揮了一定作用。 第四部分紫外線致弱日本血吸蟲尾蚴誘導(dǎo)BALB/ c小鼠早期免疫應(yīng)答動態(tài)變化的研究 【目的】觀察紫外線輻照致弱日本血吸蟲尾蚴免疫BALB/c小鼠與正常尾蚴直接攻擊正常BALB/c小鼠后,在感染早期(7、14、21天)小鼠脾、肺組織中樹突狀細胞和T細胞等免疫細胞應(yīng)答動態(tài)變化,探討致弱尾蚴免疫小鼠早期應(yīng)答特征。 【方法】清潔級10～12周齡BALB/c雌性小鼠56只,除8只作為0組不加感染/免疫外,其余平均分為2組,每組24只,分別用輻照致弱尾蚴免疫和正常尾蚴感染,感染/免疫后第7、14、21天分別剖殺小鼠,比較輻照致弱尾蚴免疫小鼠與正常感染小鼠早期脾組織中CD3~+CD25~+/CD3~+T比率分析T細胞免疫活化程度及其動態(tài)變化;結(jié)合免疫組化方法檢測以上各感染點脾組織、肺組織中樹突狀細胞表面分子CD11c、T細胞表面分子CD25表達差異。 【結(jié)果】正常尾蚴感染的小鼠肺組織炎癥反應(yīng)在第7天達到高峰后逐漸下降,第21天基本恢復(fù),而輻照致弱尾蚴免疫組小鼠肺組織在第14天炎癥反應(yīng)才達到高峰,第21天反應(yīng)仍十分強烈。紫外線輻照致弱尾蚴免疫小鼠較正常感染小鼠在攻擊感染后第7、14、21天能在肺組織募集更多的CD1lc~+DC,使得血吸蟲抗原在感染早期就能得到更有效的提呈和處理,這可能是致弱尾蚴能誘導(dǎo)高免疫保護力的原因之一;流式結(jié)果表明,脾細胞的中CD3~+CD25~+/CD3~+T比率在感染后7天正常感染對照組明顯與致弱尾蚴免疫組無明顯差異,在第14、21天,致弱童蟲移行到肺部時期,T細胞才明顯激活,CD3~+CD25~+/CD3~+T比率明顯高于正常感染對照組。 【結(jié)論】輻照致弱尾蚴免疫小鼠和正常感染小鼠肺部病理改變存在明顯差異,正常感染組肺部病理改變表現(xiàn)為一過性出血現(xiàn)象,炎癥反應(yīng)較弱;致弱尾蚴免疫組小鼠肺期病理反應(yīng)強,持續(xù)時間長,至感染后21天,肺部可見嗜酸性膿腫形成,出血灶仍然可見。在攻擊感染后7、14、21天,致弱尾蚴免疫組肺部代表樹突狀細胞分化成熟分子CD11c陽性細胞均高于正常感染對照組,提示致弱尾蚴在肺部可募集更多抗原遞呈細胞并使之活化,在感染后14、21天致弱尾蚴組代表T細胞激活程度的CD3~+CD25~+/CD3~+T比率亦高于正常感染對照組,在輻照致弱尾蚴免疫小鼠模型中對再次攻擊感染的日本血吸蟲“攔截”作用主要發(fā)生在肺期,在日本血吸蟲殺傷過程中,致弱尾蚴免疫組小鼠肺期樹突狀細胞和T細胞活化程度明顯高于正常感染對照組,對蟲體的清除起關(guān)鍵作用。 第五部分Treg細胞在紫外線致弱日本血吸蟲尾蚴免疫BALB/c小鼠體內(nèi)的表達變化研究 【目的】探討紫外線致弱日本血吸蟲尾蚴免疫BALB/c小鼠與正常感染小鼠在攻擊感染后6周、8周小鼠外周血及肝脾組織內(nèi)CD4~+CD25~+Foxp3~+調(diào)節(jié)性T細胞的分布和數(shù)量變化及其意義。 【方法】采用免疫組化染色觀察紫外線輻照致弱尾蚴免疫小鼠攻擊感染和正常感染小鼠后6周、8周小鼠肝、脾組織Foxp3的表達,同時采用流式細胞技術(shù)檢測以上兩組小鼠脾細胞與外周血中CD4~+CD25~+Foxp3~+T細胞在CD4~+CD25~+T細胞中的比率。 【結(jié)果】致弱尾蚴免疫小鼠攻擊感染和正常感染小鼠后6周、8周后免疫組小鼠肝、脾組織Foxp3的表達高于正常感染對照組,具有顯著性差異,P 0. 05 ,免疫攻擊感染組小鼠脾細胞與外周血中CD4~+CD25~+ Foxp3~+細胞占CD4~+ CD25~+細胞比例明顯高于正常感染對照組,差異具顯著性,P 0. 05。 【結(jié)論】紫外線輻照致弱免疫攻擊感染組小鼠脾細胞與外周血中CD4~+CD25~+ Foxp3~+Treg細胞比率高于正常感染對照組,其可能的機制為紫外線輻照作用有可能破壞了正常血吸蟲分泌一些抑制因子的功能,從而使免疫應(yīng)答處于比較穩(wěn)定的狀態(tài),并沒有受到血吸蟲分泌因子的調(diào)節(jié),進一步研究輻照致弱尾蚴免疫小鼠體內(nèi)Treg細胞數(shù)量和功能的變化有助于了解輻照致弱尾蚴誘導(dǎo)的免疫保護機制。 綜上所述,本論文獲得了以下研究結(jié)果: 紫外線輻照致弱日本血吸蟲尾蚴在BALB/c小鼠主要在皮膚與肺部被清除,并以肺期“攔截”為主,肺部移行階段致弱童蟲可誘導(dǎo)較強的免疫細胞反應(yīng);紫外線減毒尾蚴發(fā)育而來的致弱肺期童蟲變化可能與減毒尾蚴誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)有關(guān),而并非完全是輻照的直接損傷。 輻照致弱尾蚴免疫小鼠經(jīng)正常尾蚴攻擊感染可誘導(dǎo)較高的免疫保護作用;經(jīng)輻照致弱尾蚴多次免疫小鼠血清經(jīng)被動轉(zhuǎn)移小鼠可誘導(dǎo)較高免疫保護作用,提示在紫外線輻照致弱尾蚴誘導(dǎo)的免疫保護作用機制中體液免疫也參與了免疫保護作用。 正常尾蚴攻擊感染輻照致弱免疫小鼠,感染早期小鼠肺、脾組織可誘導(dǎo)更多樹突狀細胞的活化,從而介導(dǎo)了后期的T淋巴細胞激活;延長觀察時間至感染后6周、8周,免疫組小鼠肝、脾組織CD4~+CD25~+Foxp3~+調(diào)節(jié)性T細胞亦高于正常感染對照組,其可能的機制為紫外線輻照致弱尾蚴誘導(dǎo)免疫干擾或破壞了血吸蟲分泌一些抑制因子的功能,從而使免疫應(yīng)答處于比較穩(wěn)定的狀態(tài),并沒有受到血吸蟲分泌因子的調(diào)節(jié),以上免疫特征與輻照致弱尾蚴誘導(dǎo)較高免疫保護作用機制關(guān)系還有待進一步研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：2086028