本文選題：精子發(fā)生 + Hnrnph1/HNRNPH1�。� 參考：《南京醫(yī)科大學》2009年碩士論文

【摘要】：精子發(fā)生是在睪丸生精小管中進行的連續(xù)的、復(fù)雜的細胞分裂分化過程,該過程受到睪丸內(nèi)外多種因素的精確調(diào)控。若內(nèi)外環(huán)境失調(diào),這個嚴密過程將出現(xiàn)不同程度的紊亂,進而導(dǎo)致不育。精子發(fā)生相關(guān)蛋白在精子發(fā)生的多個階段進行不同程度的表達,在基因、蛋白、細胞等水平上對整個生精過程進行統(tǒng)籌的調(diào)節(jié)。若能掌握這些相關(guān)因子的功能,將有助于我們了解精子發(fā)生的分子調(diào)控機理,從而有針對性地解決臨床上男性不育癥問題以及為發(fā)展男性避孕方法提供新的思路。 精子發(fā)生對睪丸外環(huán)境的溫度十分敏感,升高局部溫度會導(dǎo)致睪丸可逆性的生精障礙。因此,熱作用處理的睪丸有助于我們建立研究精子發(fā)生相關(guān)蛋白的良好模型。在前期工作中,本實驗室利用雙向凝膠電泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)和質(zhì)譜(mass spectrometry,MS)分別分離和鑒定小鼠及人睪丸熱作用后不同時間點表達發(fā)生改變的蛋白質(zhì),并構(gòu)建了相應(yīng)的豐度發(fā)生顯著改變的差異表達譜。這兩個譜系中均鑒定到核內(nèi)不均一核糖核蛋白H(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H,在小鼠為Hnrnph1,在人類為其高度同源的蛋白HNRNPH1)。Hnrnph1是一種RNA結(jié)合蛋白,屬于hnRNPs超家族的亞家族hnRNP H家族,進化上相對保守,在不同的生物事件中發(fā)揮重要作用。在小鼠及人睪丸熱作用相關(guān)蛋白表達譜中這兩個蛋白顯示了相同的表達趨勢,即在生精破壞時其表達下降,在生精功能恢復(fù)時其表達升高。這一結(jié)果提示Hnrnph1/HNRNPH1可能參與調(diào)控精子發(fā)生。本研究中,我們對Hnrnph1蛋白在精子發(fā)生中的作用及其機制進行了探討。 我們首先檢測了Hnrnph1蛋白在睪丸中的表達與細胞定位。應(yīng)用商業(yè)化Hnrnph1抗體行Western blot檢測,顯示Hnrnph1蛋白在成年小鼠以及人睪丸中特異表達。接著應(yīng)用該抗體對產(chǎn)后0天、1周、2周、3周、4周的發(fā)育中小鼠睪丸,成年小鼠睪丸以及成人睪丸行免疫組化檢測,結(jié)果顯示:在小鼠睪丸及成人睪丸中,Hnrnph1主要表達于精母細胞核,在間質(zhì)細胞及支持細胞胞漿亦有表達。小鼠睪丸組織免疫熒光及分離各級生精細胞免疫熒光的結(jié)果與免疫組化一致。 進一步,我們以小鼠精母細胞系(GC2-spd)為體外實驗平臺探討Hnrnph1的功能,主要進行了以下研究: (1)首先運用Western blot方法,在蛋白水平驗證GC2-spd中有Hnrnph1表達。接著,免疫熒光顯示Hnrnph1主要表達于精母細胞系細胞核。 (2)檢測GC2-spd中Hnrnph1表達水平與細胞凋亡的相關(guān)性。我們用熱作用方法誘導(dǎo)細胞凋亡,然后檢測細胞中Hnrnph1的表達水平,以揭示其是否與凋亡相關(guān)。GC2-spd在42℃加熱孵育3h后恢復(fù)至37℃培養(yǎng),分別在復(fù)溫后0h、3h、6h、24h取細胞進行檢測,未加熱GC2-spd作為對照組。每組細胞一部分通過AV-FITC結(jié)合PI標記流式檢測凋亡,另一部分抽提細胞蛋白Western blot檢測Hnrnph1表達水平。結(jié)果顯示:熱作用后復(fù)溫24h細胞凋亡率顯著高于對照組(P0.05);而此時Hnrnph1的表達量顯著低于對照組(P0.05)。這一結(jié)果提示, Hnrnph1與GC2細胞凋亡相關(guān),可能參與調(diào)控細胞凋亡過程。 (3)抑制GC2-spd中Hnrnph1的表達后檢測其對細胞凋亡的影響。我們利用RNAi技術(shù),將干涉質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GC2-spd,構(gòu)建干涉Hnrnph1表達的穩(wěn)定細胞系。在實驗范圍內(nèi),由于熱作用后復(fù)溫24hGC2-spd細胞系凋亡最顯著,因此我們檢測了未熱作用及熱作用后復(fù)溫24h時干涉組和無關(guān)對照組的凋亡率。結(jié)果顯示:未熱作用組干涉細胞系凋亡率顯著高于無關(guān)組(P0.01),熱作用組干涉細胞系凋亡率顯著高于無關(guān)組(P0.01)。結(jié)合相關(guān)性研究,提示Hnrnph1蛋白具有抗凋亡作用。且此結(jié)果與我們在前期睪丸加熱研究中觀察到的生精破壞時該蛋白表達下降、而生精恢復(fù)時該蛋白表達升高的表達特點相符。 (4)探討Hnrnph1拮抗細胞凋亡的分子通路。運用蛋白質(zhì)組學的方法,分離和鑒定GC2-spd細胞系在干涉Hnrnph1后表達豐度發(fā)生顯著變化的蛋白質(zhì),它們可以用來描述Hnrnph1參與調(diào)控的分子通路。結(jié)果顯示:較之對照組,干涉組中有72個蛋白點表達發(fā)生改變,其中27個蛋白點表達下降,45個蛋白點表達升高。72個蛋白點對應(yīng)于66種蛋白,其中31種蛋白已有文獻報道參與調(diào)控細胞的增殖、凋亡,直接參與細胞凋亡信號傳導(dǎo)通路的蛋白有9種(Clic4/Gmfb/Hspa5/Park7/Cfl1/Sod2/Eef2/Numa1/PICOT),其中Clic4/Gmfb/ Hspa5/Park7/Cfl1/Sod2/Eef2/Numa1參與了經(jīng)典的線粒體凋亡通路。參與增殖調(diào)控的蛋白有14種(Arl3/Calu/Des/Dstn/ENO1/Fkbp52/Glo1/Naca/Pkm2/Pgk1/Psat1/ Rpsa/Set/Tubb)。另外21種蛋白質(zhì)或與細胞周期有關(guān),或參與細胞骨架形成,或與RNA翻譯、加工有關(guān),還有的與應(yīng)激保護有關(guān)。Hnrnph1蛋白通過影響這些蛋白質(zhì)的表達,調(diào)控細胞凋亡。 綜上所述,在體外,Hnrnph1蛋白是精母細胞系凋亡的負調(diào)控因子,結(jié)合細胞系體外實驗的一系列結(jié)果,我們推斷Hnrnph1是精子發(fā)生過程中一種拮抗生精細胞凋亡的保護性蛋白。它在精子發(fā)生中可能是通過直接或間接的作用,拮抗生精細胞凋亡,與眾多因子協(xié)同作用促進精子發(fā)生正常有序進行。
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【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R321

【共引文獻】

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1 李丹;丁健;林納;王小眾;;乙型肝炎病毒PreS1蛋白與初期多肽相關(guān)復(fù)合體α亞單位特異性結(jié)合的研究[J];第三軍醫(yī)大學學報;2009年23期

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本文編號：2083524